Piégeage optique de sous

Sep 14, 2023

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 8615 (2023) Citer cet article

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Alors que les pincettes optiques (OT) sont principalement utilisées pour confiner les particules de plus petite taille, les pièges à double faisceau à contre-propagation (CP) ont été une méthode polyvalente pour confiner les particules de petite et de plus grande taille, y compris les échantillons biologiques. Cependant, les pièges CP sont des systèmes sensibles complexes, nécessitant un alignement fastidieux pour obtenir une symétrie parfaite avec des valeurs de rigidité de piégeage plutôt faibles par rapport à OT. De plus, du fait de leurs forces relativement faibles, les pièges CP sont limités dans la taille des particules qu'ils peuvent confiner qui est d'environ 100 μm. Dans cet article, une nouvelle classe de pinces optiques à contre-propagation avec une symétrie brisée est discutée et démontrée expérimentalement pour piéger et manipuler des particules de plus de 100 μm à l'intérieur des milieux liquides. Notre technique exploite un seul faisceau gaussien se repliant sur lui-même de manière asymétrique formant un piège CP capable de confiner des particules petites et nettement plus grandes (jusqu'à 250 μm de diamètre) en se basant uniquement sur les forces optiques. Un tel piégeage optique de spécimens de grande taille à notre connaissance n'a pas été démontré auparavant. La symétrie brisée du piège combinée à la rétro-réflexion du faisceau a non seulement considérablement simplifié l'alignement du système, mais l'a également rendu robuste aux légers désalignements et améliore la rigidité de piégeage, comme indiqué plus loin. De plus, notre méthode de piégeage proposée est assez polyvalente car elle permet de piéger et de traduire une grande variété de tailles et de formes de particules, allant d'un micron à quelques centaines de microns, y compris des micro-organismes, en utilisant de très faibles puissances laser et des optiques à ouverture numérique. Cela permet à son tour l'intégration d'un large éventail de techniques de spectroscopie pour l'imagerie et l'étude de l'échantillon piégé optiquement. À titre d'exemple, nous démontrerons comment cette nouvelle technique permet le piégeage 3D simultané et la microscopie à feuille de lumière des vers C. elegans d'une longueur allant jusqu'à 450 µm.

Les lasers permettent des interactions lumière-matière uniques conduisant à de fortes forces optiques, à la manipulation et au piégeage des particules1,2,3,4,5,6,7,8. Le piégeage optique est un outil polyvalent aux nombreuses applications qui a permis une multitude d'études fondamentales, révolutionnant de nombreux domaines de la science et de l'ingénierie depuis sa découverte9,10,11,12,13,14,15. La mise en œuvre la plus basique mais la plus puissante des pièges optiques est le piège à force de gradient à faisceau unique, connu sous le nom de pinces optiques16,17,18. Dans cette méthode, le piège est formé lorsqu'un faisceau laser est suffisamment focalisé pour que les forces optiques exercées sur la particule d'intérêt la confinent. Ces forces sont en général classées en deux contributions principales. L'une est les forces de gradient qui attirent les particules avec un indice de réfraction plus élevé par rapport au milieu de fond dans des régions avec une plus grande intensité laser. La seconde est les forces de diffusion qui poussent principalement les particules le long de la direction de propagation du faisceau. Ces dernières forces peuvent contrecarrer le piégeage des particules, conduisant à un piège instable, en particulier pour les particules plus grosses (supérieures à 10 μm). Par conséquent, trouver une approche pratique pour compenser les effets néfastes des forces de diffusion est une étape cruciale dans le piégeage optique stable. Une solution courante consiste à utiliser des objectifs de microscope à haute NA (ouverture numérique) pour focaliser étroitement le faisceau afin que les forces de gradient augmentent au point de dépasser les forces de diffusion dans la direction axiale. Une telle focalisation nécessite généralement des objectifs de microscope avec des ouvertures numériques supérieures à un (donc du type à immersion). Cela se traduit par une courte distance de travail, un champ de vision étroit et des intensités locales extrêmes qui entrent généralement en conflit avec les besoins des applications pratiques, en particulier en biologie. Une autre approche qui peut éviter les inconvénients susmentionnés est l'utilisation de deux faisceaux identiques à contre-propagation (CP) modérément focalisés19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30. Ici, chaque faisceau équilibre les forces de diffusion vers l'avant de l'autre, générant une stabilité axiale pour former un piège 3D entre les foyers des deux faisceaux. Un tel piégeage optique à l'intérieur des suspensions a été réalisé à l'aide d'objectifs à haute NA25,26, d'objectifs à faible NA19,31, de deux fibres20,32,33,34, de pièges à miroir optique35,36,37,38,39,40,41, de phase optique la conjugaison42, les pièges holographiques à contre-propagation23,37,40 et les ondes stationnaires idéales pour piéger les nanoparticules21,22,23,24,35,36,37,38,39. Dans ces configurations de piégeage CP, puisque le piégeage se produit entre les foyers qui sont séparés par des dizaines de microns, non seulement le photodommage est atténué, mais aussi le confinement de particules plus grosses jusqu'à 100 μm (appelés macro-pièges) est devenu possible36,37,41 .

Cependant, comme le piège est formé entre les deux foyers et légèrement éloigné du foyer du faisceau (contrairement à l'OT), les forces de gradient et donc les valeurs de rigidité de la plupart de ces méthodes de piégeage du faisceau CP sont assez faibles31,36,40. Par conséquent, cela pourrait entraîner un certain mouvement latéral et une rotation lente de l'objet, en particulier dans le cas des macro-pièges41. De plus, leur rigidité de piégeage est très sensible à un alignement parfait, ce qui est dû aux exigences de symétrie des pièges à faisceau CP. En conséquence, non seulement l'alignement des méthodes à double faisceau CP pourrait être difficile, mais le positionnement précis des particules et les mesures de force seront également limités aux configurations de piégeage CP. Ce problème est exacerbé si la distance des foyers est augmentée pour étendre la plage de manipulation des particules. Cela est dû au fait que pour les pièges CP, les forces optiques et donc la stabilité du piège dépendent fortement de la séparation des foyers31,36,43. Les questions qui se posent ici sont les suivantes : peut-on modifier la configuration de la poutre double CP pour simplifier la complexité de l'alignement et par conséquent réduire la sensibilité de la raideur de piégeage à une symétrie parfaite ? Et existe-t-il un moyen d'augmenter la limite de taille de piégeage afin de confiner de manière stable les particules supérieures à 100 μm ?

Dans une étude précédente, nous avons abordé la première question en utilisant des faisceaux doubles à contre-propagation asymétrique (ACP) ainsi que l'utilisation de composants à faible NA pour former le piège optique44,45. Nous avons montré que l'asymétrie introduite dans le système à deux faisceaux CP augmente non seulement la rigidité de piégeage (par rapport aux pièges à faisceaux CP traditionnels), mais permet également d'équilibrer les forces de diffusion axiale sur une grande longueur spatiale. Cela a à son tour permis un piégeage stable et une manipulation des particules sur une plage millimétrique où la rigidité du piégeage est restée presque indépendante de la séparation des foyers.

Dans cet article, nous prévoyons de répondre à la deuxième question concernant le piégeage de particules plus grosses, mais pour ce faire, nous discuterons d'abord d'une configuration beaucoup moins complexe pour créer des pièges ACP que celle présentée précédemment44. Nous démontrerons pourquoi ce système est sensiblement plus facile à aligner et montre beaucoup moins de sensibilité aux désalignements. Ensuite, les propriétés de piégeage du système proposé sont étudiées, montrant sa capacité à manipuler facilement les particules à longue distance à l'intérieur des milieux liquides. Nos résultats indiquent des valeurs de rigidité de piège améliorées par rapport aux pièges double CP symétriques conventionnels, lorsque des conditions expérimentales similaires sont utilisées. Plus tard, nous observons les applications du système de faisceaux ACP proposé pour piéger des objets beaucoup plus grands, en particulier des échantillons biologiques allongés tels que les vers C. elegans de différentes longueurs (jusqu'à 450 µm), en utilisant uniquement des forces optiques. Enfin, nous démontrons comment des techniques d'imagerie spectroscopique telles que la microscopie à fluorescence à feuille de lumière peuvent être facilement intégrées dans ce système de piégeage stable pour générer des images plus détaillées, sans mouvement d'échantillon.

Dans le système de piégeage à double faisceau ACP44, contrairement à la configuration traditionnelle des faisceaux CP symétriques, nous utilisons deux optiques différentes avec des longueurs focales très différentes pour créer le piège. A cet effet, une lentille de longue focale de 15 cm (donc longue plage de Rayleigh) est placée d'un côté de l'échantillon, tandis qu'un objectif à faible NA (0,25 à 0,4 selon la taille des particules) est placé de l'autre côté . Ainsi, alors qu'un côté crée une focalisation relativement serrée (comme OT), l'autre côté génère un faisceau presque collimaté dans la chambre d'échantillon, se propageant dans la direction opposée. Dans un tel système, alors que l'objectif permet un confinement 2D (latéralement), les deux faisceaux ACP travaillent ensemble pour équilibrer les forces de diffusion (axialement), créant un piège 3D stable. Étant donné que l'un des deux faisceaux agit collimaté dans l'échantillon, à mesure que la focalisation plus étroite de ses faisceaux à contre-propagation se traduit, le piège se déplace sans changement de stabilité notable sur des centaines de microns, comme indiqué plus loin. Notez qu'en raison de l'objectif à faible NA utilisé, les effets thermiques sont évités.

Dans ce travail, pour générer le piège ACP, nous utilisons un système plus simplifié par rapport à nos travaux précédents44 qui n'utilise qu'un seul faisceau laser entrant, comme observé sur la Fig. 1a, décrite ci-après. Un faisceau laser entrant dans le système par la gauche est focalisé par une lentille (fl = 15 cm), formant le premier foyer avec une longue portée de Rayleigh (zr ≈ 650 µm). Ce faisceau est ensuite collecté par un objectif de microscope à faible NA et dirigé vers le miroir d'extrémité (M) et se replie sur lui-même, tout en passant deux fois à travers une roue à filtres à densité neutre variable (VND) sur son chemin, permettant des ajustements de puissance. Le faisceau rétro-réfléchi va directement dans l'ouverture arrière du même objectif de microscope et arrive à un foyer plus étroit (le deuxième foyer) quelque part à moins de zr du premier foyer, tout en se propageant dans la direction opposée formant le piège à faisceau ACP. Chaque faisceau à lui seul est incapable de piéger une particule, mais plutôt de la repousser. Ce n'est que grâce à la synergie des deux faisceaux que nous pouvons générer un piège 3D étroit qui peut se produire à n'importe quel point à l'intérieur et au-delà de zr, contrôlé par l'emplacement de l'objectif. La figure 1b montre le paysage potentiel généré par les faisceaux ACP. Pour obtenir la figure 1b, nous avons calculé la pression de rayonnement due à tous les faisceaux incidents comme \({\mathrm{S}}_{\mathrm{z}}/\mathrm{c}\), où \({\mathrm{S }}_{\mathrm{z}}\) est le vecteur de Poynting total dans la direction axiale et \(\mathrm{c}\) est la vitesse de la lumière. Pour obtenir le paysage potentiel de la figure 1b, nous avons effectué une intégrale de chemin de la pression de rayonnement dans la direction \(\mathrm{z}\) d'un point de référence arbitraire à l'emplacement d'intérêt. Le résultat est un potentiel dont le gradient donne la pression de rayonnement en chaque point de l'axe optique. La figure 1c montre la configuration utilisée dans notre laboratoire pour créer le piège ACP qui comprend à la fois l'imagerie de face et de côté. Ici, afin d'avoir une imagerie de face, nous remplaçons le miroir de la Fig. 1a par un filtre coupe-bande (NF) qui agit comme un miroir pour le faisceau laser formant le piège, tout en transmettant toutes les autres longueurs d'onde. L'objectif (MO1) est responsable à la fois de l'imagerie en vue de face et de la génération d'une mise au point plus étroite pour le piégeage optique. Pour cette raison, il repose sur une scène motorisée, de sorte que l'emplacement exact de sa mise au point est sous notre contrôle. De plus, une lame quart d'onde (\(\lambda /4\)) est placée dans le système de telle sorte qu'elle modifie la polarisation du faisceau rétro-réfléchi, empêchant la formation d'ondes stationnaires. Par rapport aux pièges à double CP conventionnels, notre configuration est nettement moins complexe, plus facile à aligner et plus robuste aux légers désalignements avec une rigidité de piégeage axiale globale plus grande, comme indiqué plus loin. Celles-ci sont principalement dues à l'utilisation d'un seul faisceau rétro-réfléchi, d'optiques à faible NA et à la rupture de symétrie des faisceaux formant le piège, autour de son centre.

Configuration de piège ACP rétroréfléchissant avec un faisceau entrant : (a) l'idée de base de la formation de piège ACP : le seul faisceau entrant entrant dans la configuration par la gauche, passe à travers la lentille pour créer un foyer lâche avec une longue plage de Rayleigh qui est collimaté par un objectif de microscope à faible NA et se replie sur lui-même par le miroir d'extrémité (M). VND est une roue filtrante à densité neutre variable. (b) Est une simulation du système ACP, démontrant la formation d'un puits de potentiel pour le piège asymétrique, lorsque la mise au point de l'objectif est à 500 µm de la mise au point de la lentille. (c) La configuration ACP rétro-réfléchissante utilisée dans nos expériences : Laser 830 nm (MSquared Equinox SolsTiS PI), L1 et L2 : deux lentilles avec f1,2 = 15 cm, L1 en combinaison avec MO1 (Olympus 20×/0.40 ou Olympus 10×/0,25 selon la taille des particules) crée un piège 3D basé sur un seul faisceau ACP rétroréfléchissant. Si nécessaire, MO1 permet la vue frontale et le suivi, où L2 est utilisé pour l'imagerie frontale. MO2 : objectif 4× (Olympus 4×/0,1) à 20× (Olympus 20×/0,40) utilisé pour la vue latérale. MO1 est monté sur une platine motorisée (MS) qui se déplace axialement. Expanseur de faisceau BE, lumière blanche WL, filtre coupe-bande NF 830 nm qui réfléchit le faisceau 830 nm, miroir dichroïque DM, S : échantillon et une lame quart d'onde (\(\lambda /4\)) pour modifier la polarisation des faisceaux de 90° après le traversant deux fois. Les deux caméras sont des caméras CMOS.

De nombreuses études utilisent un faisceau CP rétro-réfléchi pour piéger et manipuler soit des nanoparticules21,24,35,36,37,38,39 par génération d'ondes stationnaires, soit des microparticules36,40,41,43 entre deux foyers serrés de microns d'écart. Cependant, ils présentent des valeurs relativement faibles pour la rigidité du piège qui dépend fortement de la séparation des foyers31,36,43. Cela limite à son tour la plage de manipulation à des dizaines de microns au maximum et les faibles valeurs de rigidité entraînent un mouvement et une rotation des particules qui peuvent réduire la qualité de l'image dans certaines techniques de microscopie qui nécessitent des temps de balayage plus longs. Comme nous le verrons sous peu, le système de piégeage ACP proposé ici, non seulement augmente la rigidité du piège, mais conserve également sa valeur presque indépendante de la distance des foyers, permettant ainsi le piégeage, la livraison ou l'imagerie de particules et de micro-organismes plus gros sans aucun mouvement.

Pour les systèmes de piégeage CP conventionnels en général, en raison de l'optique NA inférieure utilisée (par rapport à OT), les forces de gradient sont plus petites, d'autant plus que le piège est formé entre les foyers en raison d'une symétrie parfaite. Ces forces sont encore plus faibles si la séparation des foyers est augmentée à des dizaines de microns pour augmenter la plage de manipulation31,36,43. Dans ce cas, le piégeage axial est simplement dû à l'équilibrage des forces de diffusion. Cependant, dans le cas des pièges ACP, en raison de la symétrie brisée des poutres, les valeurs de rigidité peuvent être considérablement améliorées en ajustant judicieusement les rapports de puissance de sorte que le piège ne se forme pas quelque part entre les foyers, mais plutôt à l'emplacement du concentration plus serrée. Dans ce cas, alors que les forces de diffusion axiales sont toujours équilibrées, les forces de gradient latéral ressenties par la particule sont beaucoup plus fortes en raison de sa proximité avec le foyer le plus serré. Cela est dû au fait qu'un faisceau est presque collimaté (pour des centaines de microns) tandis que l'autre est focalisé beaucoup plus étroitement, divergeant rapidement, réduisant ainsi sa pression de rayonnement loin de son foyer. Par conséquent, en ajustant les rapports de puissance, nous pouvons créer l'équilibre axial à l'emplacement du foyer le plus serré, et lorsque ce foyer est déplacé (en déplaçant l'objectif), la position du piège l'est également, comme illustré schématiquement sur la figure 2a. Ici, l'emplacement axial du puits de potentiel (position du piège) généré par le faisceau ACP est complètement dominé par la position du foyer plus serré, comme illustré à la Fig. 1b. Dans cette figure, la mise au point de la lentille est à la position zéro tandis que la mise au point de l'objectif est à 500 µm et, comme illustré dans le tracé, l'emplacement du puits potentiel généré coïncide avec la mise au point de l'objectif.

Comportement de translation des particules : (a) Une démonstration schématique de la translation de la position du piège en déplaçant l'objectif MO1. ( b, c ) Résultats expérimentaux d'une traduction de particules de 5 µm piégée (perle de polystyrène) dans l'eau le long des faisceaux ACP lorsque MO1 est traduit par pas de 100/1,33 μm dans l'espace libre (ce qui correspond à 100 μm dans l'eau). (b) Mesures des rigidités axiale et latérale du piège en fonction de la position du piège à l'intérieur de la suspension pour la particule confinée de 5 μm. ( c ) Relation expérimentale trouvée entre la translation objective axiale dans l'air et la position axiale des particules à l'intérieur de la suspension.

En utilisant la configuration illustrée à la Fig. 1c où L1 a fl = 15 cm et MO1 est un objectif 20 × avec NA = 0, 4, nous avons généré le piège ACP pour confiner une perle de polystyrène de 5 µm à l'intérieur d'une cuvette en quartz de 1 mm de large remplie d'eau. Les puissances laser utilisées sont respectivement de 50 mW et 25 mW hors lentille (L1) et objectif (MO1). Des puissances inférieures peuvent être utilisées mais cela réduit la rigidité du piège. Une fois qu'une particule tombait dans le piège (qui coïncidait avec l'emplacement du foyer de MO1), elle pouvait être déplacée vers l'avant et vers l'arrière le long des faisceaux ACP en déplaçant MO1. Les mesures expérimentales du comportement de déplacement d'une particule piégée en raison de la translation axiale de l'objectif et de la valeur de rigidité du piège à différents endroits sur une longueur de 1 mm sont démontrées sur les figures 2b, c. Dans le graphique (b), le foyer de la lentille a été fixé à l'emplacement de la paroi gauche de la cuvette et l'objectif a été déplacé par rapport à cette paroi par incréments de 100 µm/neau à l'extérieur de la chambre d'échantillon et vers la droite, où neau = 1,33. La valeur d'incrément correspond à un déplacement de 100 µm du foyer de MO1 dans l'eau. Comme le montre la figure 2c, la particule piégée suit le déplacement de MO1 avec un rapport presque un pour un jusqu'à la position 500 µm à l'intérieur de l'échantillon. Après cela, il commence à dévier et la particule se traduit légèrement moins, et la ligne commence à se plier. Cette déviation se produit car à mesure que la particule s'éloigne du foyer de la lentille, les forces de diffusion (pression de rayonnement axiale) qui lui sont imposées par le faisceau modérément focalisé (par la lentille L1) commencent à chuter plus sensiblement. Par conséquent, cela conduira à la formation d'un piège légèrement éloigné du foyer plus étroit où s'équilibrent les forces axiales.

Nous avons également caractérisé la stabilité du piège ACP en fonction de la localisation des particules à l'intérieur de la chambre d'échantillon, en mesurant les rigidités axiale et latérale (κz, κx). La figure 2b illustre les résultats des mesures de rigidité du piège après chaque 100 µm de translation axiale des particules à l'intérieur de la suspension, jusqu'à 1 mm de longueur. Dans ces mesures, la méthode PSD (densité spectrale de puissance) a été utilisée et, à chaque emplacement, les mesures sont répétées 10 fois pour les directions axiale et latérale et moyennées afin de trouver κz et κx, respectivement. Le PSD est trouvé en suivant la particule pendant 10 s, à l'aide d'une caméra CMOS à vue latérale à 1000 ips. Les premier et dernier points de données sont mesurés à 25 µm du mur pour éviter les effets de surface. Comme observé sur la figure 2b, les valeurs de rigidité axiale et latérale restent presque constantes lorsque nous déplaçons la position du piège jusqu'à ~ 500 µm. Dans cette plage, les valeurs moyennes de rigidité mesurées sont κx = 7,7 pN/µm et κz = 3,8 pN/µm, qui sont environ un ordre de grandeur plus grandes que les rigidités de piège CP conventionnelles rapportées précédemment6,36,40,41 où des paramètres expérimentaux similaires ont été utilisé. La raison de cette augmentation des valeurs de rigidité que nous démontrons ici est due à l'asymétrie de notre système qui provoque la formation du piège très près du foyer de l'objectif, ce qui entraîne une augmentation des forces de gradient ressenties par la particule qui est indépendante de la séparation des foyers jusqu'à ~ 500 µm. Pour les pièges CP conventionnels, en raison de la symétrie parfaite, le piège est formé au milieu des foyers et en fonction de leur distance, les forces de gradient sur la particule et par conséquent les valeurs de rigidité pourraient être significativement plus petites. Lorsque nous avons déplacé la particule plus loin hors de la plage de Rayleigh de la lentille, elle est restée confinée, mais les rigidités de piège mesurées ont chuté. Ce résultat est en accord avec la courbure de ligne observée dans le tracé 2c et est dû au fait que l'emplacement du piège s'écarte du foyer de l'objectif lorsque la particule est déplacée plus loin de la plage de Rayleigh de la lentille. Cette déviation réduit les forces de piégeage du gradient ressenties par la particule, entraînant une diminution des valeurs de rigidité.

En utilisant exactement la même configuration, nous avons pu piéger et traduire des particules de polystyrène d'un diamètre compris entre 1 et 100 µm, à l'intérieur d'une suspension aqueuse. Cette capacité du système ainsi que les résultats présentés sur la figure 2 démontrent la flexibilité du système ACP dans le piégeage et la manipulation des particules. La possibilité de translater et de contrôler l'emplacement axial du piège avec une précision au micron sur plusieurs centaines de microns est tout à fait unique. Ces propriétés sont très différentes des pièges CP conventionnels où l'on ne peut déplacer une particule piégée que sur des dizaines de microns avant qu'elle ne s'échappe du piège. De plus, dans le cas des pièges CP symétriques, si le foyer d'un objectif se déplace de la distance d à l'intérieur de l'échantillon, la particule piégée se déplace de d/2. Toutes ces différences découlent de l'asymétrie introduite ici.

Afin d'étudier plus avant les propriétés des pièges ACP rétro-réfléchis et en quoi ils diffèrent des pièges CP conventionnels, nous avons théoriquement modélisé les forces axiales des deux systèmes en utilisant des paramètres similaires à ceux utilisés dans nos expériences. Les résultats de cette étude sont brièvement discutés ici et peuvent être trouvés plus en détail dans la Fig. S1 supplémentaire. Nos calculs montrent que pour le piège ACP, même à de grandes séparations de foyers (de plus de 500 µm), la particule peut toujours être confinée en raison des fortes forces optiques existantes. Ce résultat est en accord avec nos résultats expérimentaux présentés sur la figure 2 et explique pourquoi nous sommes capables de translater facilement une particule piégée sur des centaines de microns. En revanche, nos résultats théoriques pour le piège CP symétrique sont en contraste avec ceux du piège ACP (avec des valeurs de rigidité latérale comparables). Pour le piège CP symétrique, si la séparation des foyers devient supérieure à des dizaines de microns, leurs forces axiales deviennent trop petites et un piège 3D stable devient impossible. Ce résultat est en accord avec les rapports précédents concernant les pièges CP conventionnels où leur rigidité de piégeage est une fonction forte de la séparation des foyers36,43 et diminue rapidement à mesure que la séparation des foyers augmente. Cela limite à son tour la zone de manipulation à des dizaines de microns pour les pièges CP. Dans une autre étude théorique, nous avons étudié la capacité de traduction des pièges ACP et CP en modifiant uniquement les rapports de puissance des deux côtés. Nos résultats présentés dans la Fig. S1a supplémentaire indiquent que la modification des rapports de puissance dans les deux cas ne déplacera l'emplacement du piège que de quelques dizaines de microns. Dans l'ensemble, nos résultats de l'étude de la force axiale suggèrent comment l'asymétrie introduite dans le système de piégeage CP conventionnel peut étendre considérablement la plage de force optique et, par conséquent, augmenter notre contrôle sur l'emplacement exact du piégeage dans un chemin millimétrique.

Jusqu'à présent, nous n'avons démontré que le confinement des petites particules à l'aide du piège ACP rétro-réfléchi proposé. Cependant, comme nous le verrons bientôt, cette technique est très adaptée pour piéger des particules de taille macro significativement plus grandes qui peuvent être sphériques ou non sphériques. Dans cette section, nous commencerons par le piégeage 3D de grosses billes de polystyrène puis nous démontrerons le confinement d'échantillons biologiques vivants. En utilisant d'abord la configuration de la Fig. 1c (où MO1,2 sont des objectifs 10 × avec NA de 0, 25), nous avons pu piéger des billes de polystyrène de 150 µm dans une suspension aqueuse, comme illustré à la Fig. 3a. La vidéo de ce confinement se trouve dans la visualisation supplémentaire 1. Nous avons ajouté des billes de polystyrène de 10 µm à la suspension, à des fins de comparaison, comme le montre la figure 3a. Nous avons également pu translater la particule de 150 µm en déplaçant lentement MO1. La séquence d'images montrant la traduction de cette perle est présentée dans la visualisation supplémentaire 2. La puissance laser utilisée pour piéger une si grosse perle de polymère était de 100 mW au total : 67 mW du faisceau sortant de la lentille L1 et 33 mW du faisceau rétro-réfléchi sortant MO1 et entrée de l'échantillon. Il est important de noter que dans une recherche précédente48, une sphère de polymère de 100 µm était piégée entre deux fibres avec une puissance de piégeage de 800 mW à partir de chaque bras de fibre. Par rapport à cette étude, les niveaux de puissance utilisés dans notre étude sont significativement plus petits et la particule piégée ici est 1,5 fois plus grande. La puissance plutôt faible requise pour le piégeage, ainsi que la capacité de confiner des objets beaucoup plus gros, indiquent que le piège à faisceau ACP est un outil idéal pour piéger des spécimens biologiques.

Piégeage d'objets de taille micronique beaucoup plus grands à l'aide du système de piégeage ACP rétro-réfléchi. Confinement de : (a) billes de polystyrène 150 µm, (b) Volvox 115 µm et (c) micro-organismes vivants Micrasterias Waris 250 µm.

Ensuite, en utilisant la même configuration et les mêmes paramètres, nous avons pu facilement piéger 115 µm Volvox (Fig. 3b) et 250 µm Micrasterias Waris (Fig. 3c) des micro-organismes vivants dans l'eau. La vidéo de Micrasterias Waris piégé est disponible dans la visualisation supplémentaire 3.

De nombreux échantillons biologiques sont allongés ou en forme de bâtonnets, tels que les chromosomes, les organites intracellulaires, une grande variété de bactéries et de parasites, les tubules membranaires, certaines microalgues et micro-vers. Le piégeage optique de tels échantillons nécessite généralement des systèmes complexes impliquant la mise en forme du faisceau. Par conséquent, le piégeage optique 3D de particules en forme de bâtonnet dans une orientation spécifique peut être difficile ou impossible. Ici, en intégrant un deuxième faisceau laser dans le système de piégeage ACP rétroréfléchissant, comme illustré à la Fig. 4, nous pouvons facilement piéger des objets allongés ou en forme de tige, comme décrit ci-après. Le deuxième faisceau, qui est choisi à une longueur d'onde légèrement différente (λ = 785 nm avec ~ 30 mW) est combiné avec le faisceau rétro-réfléchi à 830 nm à l'aide d'un DM (miroir dichroïque), tous deux entrant dans MO1 en copropagation. Les deux faisceaux traversent l'échantillon (B2 et B3 sur la Fig. 4a) en se concentrant à deux endroits distincts, où leur distance peut être simplement contrôlée en déplaçant la lentille L3 (fl = 15 cm qui modifie la divergence du faisceau laser à 785 nm). La combinaison des trois faisceaux (B1, B2 et B3 avec ~ 80 mW, ~ 30 mW et ~ 30 mW, respectivement) forme un piège 3D pour les objets allongés. En utilisant ce système, nous avons réussi à piéger les micro-organismes Paramecium aurelia (Fig. 4c) et Caenorhabditis elegans (C. elegans) (Fig. 4d, e). Les vers C. elegans confinés étaient à différents stades larvaires avec différentes tailles allant de 250 à 450 µm de longueur. Le média d'une larve (stade L2) confinée dans notre double piège ACP, se trouve dans la Visualisation Supplémentaire 4.

(a) Le schéma des faisceaux ACP à double piège proposés pour confiner des objets allongés en utilisant une combinaison de trois faisceaux. B1 est le faisceau de 830 nm focalisé via L1 (fl = 15 cm) avec une longue plage de Rayleigh, B2 est le faisceau rétro-réfléchi étroitement focalisé via MO1 (Olympus 10 × / 0,25). B3 est un faisceau laser de 785 nm également focalisé par MO1 légèrement après le foyer de B2. (b) Modification de la configuration du faisceau ACP pliable pour obtenir un confinement 3D pour les objets allongés. Ici MO1 est 10× avec NA 0,25, MO2 varie entre 4×, 10× et 20× objectif selon la taille de l'objet et l'application. (c–e) sont les images en fond clair de micro-organismes piégés optiquement : (c) 130 µm Paramecium aurelia, (d) 260 µm, (e) 385 µm C. elegans larves.

Ensuite, nous avons ajouté la microscopie à fluorescence à feuille de lumière au système de piégeage ACP illustré sur la figure 4b pour le piégeage et l'imagerie 3D simultanés des larves de C. elegans piégées. Pour cette microscopie, les gouttelettes lipidiques de la larve ont été colorées avec le colorant fluorescent rouge de Nil (une tache lipophile qui émet une fluorescence dans un environnement lipidique). Comme le montre la figure 5a, nous utilisons un laser à 532 nm pour exciter le ver confiné coloré C. elegans. Le faisceau est focalisé par une lentille cylindrique (CL avec fl = 7,5 cm) sur un miroir de direction (SM) puis relayé vers l'ouverture arrière de l'objectif MO3 (10× avec NA de 0,3) par une combinaison de lentilles relais (deux lentilles identiques L2 et L3 avec fl = 5 cm). La fluorescence est collectée perpendiculairement au plan d'éclairage avec un objectif de microscope à immersion dans l'eau 20 × (MO2) avec NA de 0, 6 et imagée sur la caméra CMOS à vue de dessus. L'image en champ clair d'une larve de C. elegans colorée à 450 µm est illustrée à la Fig. 5b. Un exemple d'une image de feuille de lumière en coupe prise parallèlement au plan sur lequel repose la larve est présenté à la Fig. 5c.

( a ) La configuration optique agrandie montrant uniquement les objectifs et les lentilles impliqués dans le piégeage optique (L1 et MO1) et la microscopie à fluorescence à feuille de lumière (MO2, MO3 et L2 à L4). Ici : Lentille cylindrique CL avec fl = 7,5 cm, MO3 est un objectif 10× avec NA de 0,3 (Olympus UPlanFL N 10×/0,30) tandis que MO2 est un objectif à immersion dans l'eau 20× avec NA de 0,6 (Thorlabs TL20X-MPL 20×/ 0,60 W/400–900 nm \(\infty\)/WD 5,5 mm). L2 et L3 sont des systèmes de lentilles relais avec fl = 5 cm. L4 avec fl = 10 cm est utilisé pour l'imagerie. ( b ) est la microscopie à fond clair d'une larve de C. elegans colorée à 450 µm et ( c ) est l'image de microscopie à fluorescence à feuille de lumière de la même larve illustrée en ( b ).

Il convient de noter ici que pour les objets piégés plus petits (≤ 100 µm), nous n'avons pas eu besoin d'ajouter MO3 pour la microscopie à feuille de lumière, puisque MO1 pouvait être utilisé à la fois pour le piégeage et la formation de feuille de lumière. Ceci pourrait être facilement réalisé en utilisant un miroir dichroïque pour combiner le laser d'excitation (ici 532 nm) avec le faisceau rétro-réfléchi, avant d'entrer dans MO1. Ici, nous n'avons démontré qu'une seule technique d'imagerie possible (microscopie à feuille de lumière) qui a été facilement intégrée dans notre configuration de piégeage optique. Cependant, puisque notre système, contrairement à la plupart des études précédentes, permet aux objets d'intérêt d'être confinés à l'intérieur d'une chambre beaucoup plus grande et sans contrainte physique stricte (comme l'utilisation d'une lamelle ou d'agarose), il permet l'intégration d'une variété de techniques d'imagerie ( avec un grand champ de vision) pour mieux étudier les bio-échantillons et leur évolution. Par conséquent, notre système a le potentiel de l'imagerie 4D (imagerie 3D dans le temps) afin d'étudier des dynamiques spécifiques dans la bio-matière.

En résumé, nous avons démontré comment la rupture de la symétrie du système de piégeage optique à contre-propagation bien connu peut modifier les forces optiques globales conduisant à une stabilité de piégeage accrue et permettant le piégeage et la manipulation de particules à longue portée dans les milieux liquides. Bien qu'il existe de nombreux rapports sur la manipulation de particules à longue portée via des pincettes optiques, la plupart d'entre eux sont effectués dans des milieux gazeux ou sous vide et reposent principalement sur des forces thermophorétiques29,46,47. Ici, nous piégeons et manipulons une large gamme de particules de tailles et de formes différentes, y compris des micro-organismes, en utilisant des forces de pression de rayonnement et sans créer d'ondes stationnaires22 ou d'effets thermiques. En raison de l'asymétrie autour du piège créée par la combinaison lentille-objectif, la sensibilité de la rigidité du piège à la séparation des foyers est extrêmement réduite, ce qui permet à son tour un piégeage à une séparation étendue des foyers, ce qui n'est pas possible avec les pièges CP conventionnels. De plus, la symétrie brisée combinée à la rétro-réflexion du faisceau et à l'utilisation d'un seul objectif à faible NA ont non seulement considérablement simplifié l'alignement, mais l'ont également rendu très robuste et rentable. La configuration ACP proposée a augmenté les rigidités de piégeage axial d'au moins un ordre de grandeur par rapport aux poutres CP symétriques qui ont des paramètres expérimentaux similaires. Bien que notre configuration partage la simplicité et la flexibilité d'une pince optique à faisceau unique, elle permet l'utilisation d'objectifs avec de très petits NA pour le piégeage des particules. Cela se traduit par une distance de travail et un champ de vision plus grands tout en évitant les effets thermiques indésirables. Ceci est particulièrement intéressant lorsqu'un piégeage et une manipulation non invasifs en champ lointain sont souhaités à l'intérieur d'un milieu liquide. Tous ces avantages rendent ce système très pratique pour le piégeage optique à longue portée pour une variété d'échantillons et permettent la possibilité d'intégrer des techniques de microscopie basées sur la spectroscopie, comme démontré ici. Il convient de mentionner que depuis quelques années, des techniques telles que les pièges à miroir optique36,37 (ou les macro-pinces optiques41) utilisent toutes un miroir derrière l'échantillon pour former des faisceaux de piégeage contre-propagatifs, mais il existe des différences majeures. Alors que la plupart de ces études utilisent un modulateur spatial de lumière (SLM), ce qui rend leur configuration assez complexe et coûteuse, le miroir rétro-réfléchissant utilisé est placé dans la chambre d'échantillon, ce qui rend la préparation de l'échantillon et l'imagerie latérale assez difficiles. Dans notre méthode proposée, le miroir (qui est un NF) est placé loin de l'échantillon permettant un accès en vue latérale sans avoir besoin d'une préparation spéciale de l'échantillon ou de techniques d'imagerie compliquées. De plus, l'asymétrie unique de nos faisceaux de piégeage crée des capacités de piégeage et de manipulation 3D stables au millimètre près avec des valeurs de rigidité améliorées absentes des études susmentionnées en raison de leur symétrie de faisceau.

Les données ne sont pas accessibles au public mais peuvent être obtenues auprès de Shima Fardad sur demande raisonnable.

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Département de génie électrique et d'informatique, Université du Kansas, Lawrence, 66045, États-Unis

Laurynas Lialys, Justinas Lialys, Alessandro Salandrino & Shima Fardad

I2S, Institut des sciences de l'information, Université du Kansas, Lawrence, 66045, États-Unis

Alessandro Salandrino & Shima Fardad

Département de biosciences moléculaires, Université du Kansas, Lawrence, 66045, États-Unis

Brian D. Ackley

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LL et JL ont conçu et configuré le système, mené les expériences et collecté les données. SF, AS et BA ont rédigé le manuscrit. Tous les auteurs ont examiné le manuscrit.

Correspondance à Shima Fardad.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Lialys, L., Lialys, J., Salandrino, A. et al. Piégeage optique de particules et de micro-organismes de taille submillimétrique. Sci Rep 13, 8615 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35829-7

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Reçu : 02 mars 2023

Accepté : 24 mai 2023

Publié: 27 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-35829-7

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