Une imprimante de vaccins à micro-aiguilles pour COVID thermostable

Jun 09, 2023

Nature Biotechnology (2023)Citer cet article

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La fabrication décentralisée de vaccins thermostables à ARNm sous forme de patch à micro-aiguilles (MNP) pourrait améliorer l'accès aux vaccins dans les communautés à faibles ressources en éliminant le besoin d'une chaîne du froid et d'un personnel de santé qualifié. Nous décrivons ici un processus automatisé d'impression de vaccins à ARNm MNP Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) dans un appareil autonome. L'encre du vaccin est composée de nanoparticules lipidiques chargées d'ARNm et d'un mélange de polymères solubles qui a été optimisé pour une bioactivité élevée en criblant des formulations in vitro. Nous démontrons que les MNP résultants sont stables pendant au moins 6 mois à température ambiante lorsqu'ils sont évalués à l'aide d'une construction d'ARNm modèle. L'efficacité du chargement du vaccin et la dissolution des micro-aiguilles suggèrent que des doses efficaces à l'échelle du microgramme d'ARNm encapsulés dans des nanoparticules lipidiques pourraient être délivrées avec un seul patch. Les immunisations chez les souris à l'aide de MNP produits manuellement avec un ARNm codant pour le domaine de liaison au récepteur de la protéine de pointe du coronavirus 2 (SRAS-CoV-2) du syndrome respiratoire aigu sévère stimulent des réponses immunitaires à long terme similaires à celles de l'administration intramusculaire.

Les communautés non vaccinées des pays à revenu faible ou intermédiaire sont exposées à un risque élevé d'épidémies répétées de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) et d'autres maladies infectieuses1, qui augmentent la mortalité, favorisent l'émergence de variantes plus dangereuses et ont un impact négatif sur l'économie2. La vaccination de masse dans ces communautés a été entravée par des problèmes tels que des infrastructures de stockage et de transport compatibles avec la chaîne du froid et un nombre insuffisant de personnel de santé3,4. Les systèmes distribués et locaux de fabrication de vaccins adaptés offrent une solution potentielle. Un format de vaccin prometteur dans ces régions est les patchs à micro-aiguilles thermostables (MNP)5,6,7,8. Les MNP peuvent être auto-appliqués, sont moins douloureux que l'injection intramusculaire (IM), ne produisent pas de déchets tranchants, peuvent être formulés pour rester stables pendant des mois et ont été utilisés avec plusieurs types de vaccins, y compris divers acides nucléiques9,10,11,12,13,14. Dans le contexte de COVID-19, les vaccins à ARNm encapsulés dans des nanoparticules lipidiques (LNP), tels que ceux produits par Moderna et Pfizer-BioNTech, se sont avérés très efficaces pour prévenir les maladies graves. À notre connaissance, la livraison intradermique (ID) d'un vaccin à ARNm dans un véhicule LNP utilisant un MNP avec une thermostabilité à long terme n'a pas été rapportée auparavant.

La fabrication de MNP introduit de nouveaux défis en matière de fabrication, de chargement et d'évolutivité qui ont ralenti leur développement, bien qu'ils soient idéaux pour un déploiement dans des zones à faibles ressources15,16,17,18. Pour un dosage précis et une pénétration cutanée adéquate, les micro-aiguilles doivent être pointues et de taille constante d'un lot à l'autre19. Les MNP sont limités par le petit volume disponible pour le chargement du vaccin, en particulier lorsque des excipients sont nécessaires pour stabiliser les antigènes labiles20. Les MNP sont généralement fabriqués à la main individuellement avec des étapes à forte intensité de main-d'œuvre, manuelles et imprécises, telles que la centrifugation, ce qui rend difficile la fabrication cohérente et automatisée à l'aide de ces méthodes21.

Nous décrivons ici une imprimante de vaccins à micro-aiguilles (MVP) pour fabriquer des MNP solubles chargés de vaccins à ARNm encapsulés dans des LNP ou d'autres cargaisons (Fig. 1a à c). L'intégration d'un processus de fabrication de micro-aiguilles dans un dispositif autonome et modulaire présente des défis uniques. La formation de microaiguilles, qui est généralement obtenue par moulage22, fabrication de gouttelettes23, impression à jet d'encre24,25 ou impression 3D26,27,28, doit produire des microaiguilles avec des caractéristiques nettes, précises et à l'échelle du micron. Le remplissage des moules doit être piloté par un processus reproductible qui minimise les déchets, réduit les pièces mobiles, ne nécessite aucune interaction de l'utilisateur et s'intègre dans un flux de travail automatisé piloté par la machine. À chaque cycle, le MVP distribue de l'encre de vaccin remplit des moules à micro-aiguilles sans perturber l'encre en utilisant le vide pour éliminer l'air à travers le moule, et accélère le séchage à l'aide d'un flux de travail automatisé avec une intervention humaine minimale. Le flux de travail automatisé intègre un distributeur robotique de haute précision, une chambre à vide programmable et des étapes de mouvement modulaires contenant des moules à micro-aiguilles réutilisables. Le processus utilisé dans le dispositif est basé sur une application sous vide, compatible avec une large gamme de conceptions de MNP et optimisé pour minimiser les déchets de vaccins.

a, les encres modulaires contenant de l'ARNm, des lipides et du polymère peuvent être personnalisées pour l'impression de vaccins à micro-aiguilles. b,c, Le MVP (b) peut être distribué dans des régions éloignées pour fournir une capacité de fabrication locale (c) de MNP thermostables. d, Après la distribution automatisée, le vide est appliqué à travers le PDMS pour charger la solution polymère-vaccin dans le moule à micro-aiguilles. Les moules sont ensuite transférés vers une station de séchage pour un séchage accéléré. e, Le temps nécessaire pour charger la solution polymère-vaccin dans le moule PDMS a été mesuré pour divers paramètres de conception et de processus. Des tests t bilatéraux non appariés ont été utilisés pour toutes les comparaisons, à l'exception du type de polymère, où une ANOVA unidirectionnelle ordinaire a été utilisée (n = 3 échantillons indépendants). f, taux de séchage pour différentes stratégies de séchage. L'ANCOVA a été utilisée pour comparer les estimations du taux de séchage, qui ont été dérivées d'une régression linéaire des données sur le taux de séchage (n = 3 échantillons indépendants). g, la zone de chute totale (n = 3 échantillons indépendants) et la couverture du patch (n = 100 échantillons indépendants) sont fonction de la solution de polymère utilisée pour la distribution. h, Imagerie des MNP fabriqués avec l'appareil : MNP sur support solide acrylique (en haut à gauche), image SEM de MNP avec des géométries coniques (en haut à droite) et pyramidales (en bas à gauche) et une seule pyramide MNP (en bas à droite). i, Images de MNP chargés par la pointe (encadrés en blanc) co-distribués avec l'appareil en utilisant un colorant rouge (en haut) ou bleu (en bas) comme cargaison modèle. j, débit de production de MNP. k, débit MNP en fonction du temps de séchage et de la longueur du plateau d'impression. Les données représentent la moyenne ± écart-type (e, g) ou la moyenne ± intervalle de confiance à 95 % (f). Les valeurs P sont représentées par : *P ≤ 0,05 ; **P ≤ 0,01 ; ***P ≤ 0,001 ; ****P ≤ 0,0001. NS, non significatif.

L'impression par micro-aiguille nécessite l'incorporation d'un polymère soluble stabilisant dans une encre ARNm-LNP systématiquement dispensable. Après un criblage approfondi des encres in vitro, nous avons déterminé qu'une combinaison de polymères solubles pouvait délivrer avec succès de l'ARNm actif encapsulé dans le LNP et maintenir la stabilité pendant au moins 6 mois à température ambiante. En utilisant l'ARNm codant pour le domaine de liaison au récepteur (RBD) de la protéine de pointe (S) du SRAS-CoV-2, nous montrons que les MNP produits par le MVP ont des propriétés mécaniques adéquates et pénètrent avec succès l'épiderme porcin lors d'une application ex vivo. Les tests in vivo de MNP produits manuellement ont démontré une réponse immunitaire similaire à celle de l'administration IM.

Nous avons développé une technique basée sur le vide pour enfoncer des encres de vaccin visqueuses dans des moules. Le procédé est basé sur la perméabilité et la solubilité de l'air dans le polydiméthylsiloxane (PDMS)29. En appliquant le vide directement au fond du moule PDMS pendant le remplissage (Fig. 1d et Données étendues Fig. 1a) ou en pré-dégazant le moule PDMS immédiatement avant le remplissage (Données étendues Fig. 1b), des solutions visqueuses de polymère et de vaccin pourraient être chargées dans des moules (Vidéos supplémentaires 1 et 2).

L'effet de divers paramètres de processus et de conception sur le temps de chargement et la formation de MNP a été étudié pour les deux approches (données étendues Fig. 1c – j). Lors de l'application du vide directement sur le moule, le temps de chargement dépend de l'épaisseur et de la composition de la feuille PDMS, du modèle utilisé pour appliquer le vide sous le moule PDMS et du gradient de pression appliqué (Fig. 1e). Le chargement d'encres de plus en plus visqueuses (Extended Data Fig. 1k) a nécessité moins de 20 min. Bien que l'application du vide lors de la fabrication des micro-aiguilles soit courante, le vide est généralement appliqué à l'atmosphère au-dessus du moule, ce qui entraîne la formation de bulles dans la solution de vaccin et de polymère30,31. L'application du vide directement sur le moule PDMS empêche la formation de bulles et élimine le besoin de centrifugation, fournissant un processus reproductible permettant l'automatisation, et il peut être augmenté ou réduit pour répondre à n'importe quelle taille ou quantité de MNP.

Pour réduire le gaspillage de vaccins et le temps de séchage, nous avons distribué le volume minimum possible d'encre de vaccin nécessaire pour remplir les micro-aiguilles. Nous avons ajusté la concentration de polymère pour obtenir un film mince et homogène de polymère séché avec une résistance mécanique suffisante pour survivre au démoulage (données étendues Fig. 2a). La distribution a été caractérisée par la zone de goutte d'encre distribuée et la circularité du support formé après séchage. En augmentant la viscosité pour minimiser l'effet Marangoni - qui entraîne le polymère et le vaccin sur les bords de la gouttelette de séchage - nous avons maximisé la circularité et la couverture du moule, mesurées en aiguilles remplies par moule (Données étendues Fig. 2b, c). En utilisant une analyse thermogravimétrique pour évaluer le temps de séchage, nous avons déterminé que l'application simultanée de vide en dessous et d'une atmosphère de vide desséchée au-dessus, les moules MNP accéléraient le séchage par patch sans formation de bulles (Fig. 1f et note complémentaire 1).

Pour minimiser l'interaction de l'utilisateur et le besoin de formation sur site, les processus ci-dessus ont été automatisés à l'aide de composants programmables. Une étape de traduction x-y personnalisée avec vide en dessous (chargement) et au-dessus (séchage), pouvant accueillir jusqu'à 100 moules MNP à la fois, a été fabriquée (Vidéo supplémentaire 3 et Données étendues Fig. 3a – e). Les processus de chargement sous vide et de séchage sous vide ont été combinés à un bras robotisé pour une distribution reproductible et programmable avec une précision à l'échelle du microlitre (vidéos supplémentaires 4 et 5 et données étendues Fig. 3f). Des paramètres tels que le modèle de distribution, le volume distribué et la hauteur de distribution ont été optimisés pour minimiser les déchets de vaccins et produire des MNP avec un support ultrafin (Extended Data Fig. 3g – k). Avec un ensemble de paramètres de distribution, trois systèmes de polymères solubles différents ont été distribués avec une couverture de moule supérieure à 80 % (Fig. 1g). Le MVP a permis la fabrication automatisée de diverses conceptions de micro-aiguilles, y compris des réseaux 10 × 10 (données étendues Fig. 3l) de micro-aiguilles pyramidales et coniques jusqu'à 1 500 µm de haut fabriqués à partir d'une sélection de polymères solubles courants pour l'administration de vaccins à l'aide de MNP (Fig. 1h).

Le vaccin qui sèche dans le support du MNP crée des déchets de vaccin supplémentaires. Pour réduire les déchets, nous avons mis en place un processus de chargement des pointes en deux étapes qui a déjà été utilisé pour concentrer le vaccin dans les pointes de micro-aiguilles8,32. Tout d'abord, une encre de vaccin contenant la quantité minimale de polymère nécessaire pour stabiliser le vaccin est chargée dans le moule et séchée. Ensuite, une encre uniquement polymère est distribuée et séchée pour former le support (données étendues Fig. 4a, b). Le MVP peut également être utilisé pour basculer le chargement de plusieurs cargaisons simultanément, comme le montre le chargement de colorant rouge et bleu dans différents MNP (Fig. 1i). Les MNP à pointe chargée imprimées avec le MVP ont des micro-aiguilles pointues correctement formées à 100 % (Extended Data Fig. 4c).

Un modèle mathématique a été développé pour quantifier le nombre de patchs pouvant être fabriqués par jour en fonction de différents paramètres de conception (Notes supplémentaires 2 et 3 et données étendues Fig. 4d – g). Le débit du MVP est limité par l'étape de processus la plus lente, qui peut être l'étape de distribution ou l'étape de séchage en fonction de la taille de l'appareil, ce qui démontre l'importance de comprendre les deux (Fig. 1j). Un traitement continu est possible lorsque les processus des composants sont toujours en cours d'exécution et que les débits de distribution et de séchage sont égaux. Divers contours de conception ont été tracés pour capturer le débit de tout appareil en tenant compte de paramètres tels que le temps de séchage et la dimension du plateau de chargement (Fig. 1k) ou la taille du patch (Données étendues Fig. 4d).

Bien qu'une imprimante de première génération soit capable de fabriquer 100 patchs en 48 h, cela peut être augmenté en modifiant la taille et la complexité de l'étape de distribution et de la zone de séchage. Le modèle peut être un outil d'intégration pour éclairer les considérations de conception en vue d'augmenter le débit. Ceci peut être réalisé efficacement en empilant verticalement des moules modulaires de plateaux à micro-aiguilles dans le MVP (données étendues Fig. 5a, b) ou en fabriquant en continu des MNP en utilisant une étape de prétraitement pour dégazer les plateaux de moules à micro-aiguilles avant la distribution (données étendues Fig. 5c). Le retrait et l'emballage des patchs pourraient également être automatisés dans les conceptions futures à l'aide d'un bras robotisé (Extended Data Fig. 5d – g).

Le MVP a ensuite été utilisé pour charger divers produits biologiques, en particulier des LNP chargés de protéines, d'ADN et d'ARNm. Le chargement de pointe en deux étapes avec BSA augmente considérablement l'efficacité de chargement, définie comme le pourcentage de cargaison utilisée pour la fabrication qui est mesurée dans les pointes de micro-aiguilles, par rapport à la fabrication MNP en une étape (Fig. 2a). La masse d'encre de vaccin utilisée au cours de la première étape du processus en deux étapes a ensuite été optimisée pour obtenir une efficacité de chargement élevée (données étendues Fig. 6a, b). Nous avons observé que l'efficacité de chargement augmente avec la diminution de la masse de formulation (Extended Data Fig. 6c). En utilisant la meilleure procédure de chargement, 32 µg d'ADN et 90 µg de BSA ont été chargés et distribués simultanément à l'aide du MVP, avec une efficacité de chargement similaire (Fig. 2b). Le chargement obtenu avec le MVP correspondait à ce qui est obtenu lorsque les MNP sont fabriqués manuellement par des techniques de laboratoire standard, confirmant en outre l'automatisation réussie du processus de fabrication pour divers antigènes et vecteurs (Fig. 2b). La hauteur de distribution a été réduite pour réduire la variance de chargement (données étendues, Fig. 6d). Le chargement d'un vaccin à ADN est cohérent (sd = 1,6 µg) sur la surface d'un plateau avec 100 moules MNP sans tendances détectables en fonction de la position (Fig. 2c et Extended Data Fig. 6e).

a, Efficacité de chargement des micro-aiguilles en une et deux étapes (n = 6 échantillons indépendants). b, l'efficacité du chargement de l'ADN et des protéines dans les MNP fabriqués manuellement est similaire à celle réalisée à l'aide du MVP (n = 4 à 9 échantillons indépendants). c, carte thermique montrant le chargement constant d'ADN dans les MNP sur un plateau 10 × 10 de moules MNP. Chaque carré est un patch individuel. Les flèches noires indiquent le mouvement du distributeur de vaccins. d, les MNP consistent en un polymère stabilisant et des LNP, qui ont quatre composants lipidiques. e, f, les LNP encapsulant l'ARNm qui code pour fLuc ont été mélangés avec divers polymères solubles dans l'eau et séchés. L'expression protéique dans les cellules HeLa a été mesurée après transfection avec un polymère redissous pour cribler une combinaison de polymères qui produit une expression protéique similaire aux LNP en suspension (n = 4 répétitions techniques). g, les micro-aiguilles se dissolvent et délivrent des vaccins ARNm-LNP dans l'espace intradermique. h, luminescence 6 h après l'application sur le coussinet plantaire de MNP chez la souris pour les LNP fabriqués avec le lipide 5 ou le cKK-E12 (n = 5 échantillons biologiquement indépendants). i, Comparaison de l'IM, de l'administration manuelle de MNP et de MNP imprimés de LNP du lipide 5 contenant 1 µg d'ARNm de fLuc (n = 5 échantillons biologiquement indépendants). Les données représentent la moyenne ± sd (a,b,e,f) ou la moyenne ± sem (h,i). Des tests t non appariés et bilatéraux (a, b), une ANOVA bidirectionnelle ordinaire (h) ou une ANOVA unidirectionnelle ordinaire (i) (test de comparaisons multiples de Sidak) ont été utilisés. Les valeurs P sont représentées par : *P ≤ 0,05 ; **P ≤ 0,01 ; ***P ≤ 0,001 ; ****P ≤ 0,0001. ave., moyenne ; dév., déviation ; NS, non significatif.

Ensuite, nous avons testé l'impression de MNP qui incorporent des ARNm-LNP stabilisés dans une matrice polymère soluble. Les LNP sont particulièrement difficiles à sécher dans une matrice solide car la stabilité chimique et colloïdale doit être préservée33. De plus, le volume de polymère disponible dans les microaiguilles est limité, ce qui rend difficile la prévention de l'agrégation des LNP. Pour étudier les polymères solubles pour stabiliser les LNP, nous avons comparé divers polymères biocompatibles couramment utilisés pour fabriquer des microaiguilles solubles en fonction de leur capacité à maintenir la stabilité des LNP à des rapports de masse polymère/ARNm décroissants. Des LNP d'environ 147 nm de diamètre et d'un potentiel de surface de -2,7 ± 0,6 mV encapsulant l'ARNm codant pour la luciférase de luciole (fLuc) ont été fabriqués à l'aide de lipides ionisables, de phospholipides, de cholestérol et de lipides pégylés (Fig. 2d et Extended Data Fig. 7a – c)34.

Les LNP ont ensuite été mélangés avec divers polymères solubles et séchés. Après redissolution de la matrice sèche, des LNP ont été utilisés pour transfecter des cellules HeLa, et la viabilité cellulaire et l'expression de fLuc ont été mesurées par rapport à des LNP frais et non séchés. Aucune des formulations testées n'a altéré la viabilité cellulaire par rapport aux LNP seuls (Extended Data Fig. 7d). Les formulations contenant plus de 50% d'alcool polyvinylique (PVA) de la masse totale sont les meilleures pour stabiliser les LNP (Fig. 2e), tandis que d'autres matériaux MNP solubles courants fonctionnent mal (Fig. 2f). La vitesse de séchage lente du PVA (données étendues Fig. 7e), l'hygroscopicité et la viscosité (données étendues Fig. 1k) peuvent être surmontées en le mélangeant avec de la polyvinylpyrrolidone (PVP - un polymère à séchage plus rapide avec des propriétés mécaniques souhaitables (données étendues Fig. 7f, g) - sans sacrifier la stabilité. Les LNP sont intacts après la dissolution de la matrice polymère MNP - montrant une augmentation modérée du diamètre (données étendues Fig. scopie (TEM) (données étendues Fig. 7i – k) et taille d'ARNm préservée (données étendues Fig. 7l).

Nous avons cherché à sélectionner une formulation de LNP adaptée à l'administration ID via MNP (Fig. 2g) à partir de deux principaux lipides ionisables différents avec des structures et des pKa très différents : cKK-e12 et Lipid 5 (réfs. 34,35,36). cKK-e12 a été largement rapporté efficace pour délivrer des oligonucléotides par administration intraveineuse (IV), tandis que le lipide 5 a été sélectionné dans une famille de lipides étudiés pour la délivrance IM et IV. Les LNP de chaque type encapsulant l'ARNm de fLuc ont été caractérisés (Extended Data Fig. 7a – c) et chargés dans les micro-aiguilles des MNP en utilisant la meilleure formulation de polymère soluble stabilisant et la méthode de chargement la plus efficace, c'est-à-dire le rapport de masse PVP: PVA 1: 1 et fabrication en deux étapes. La charge d'ARNm encapsulé dans chacune des 100 microaiguilles d'un MNP a été mesurée. Nous avons constaté que, bien que la distribution de l'ARNm au sein du MNP soit hétérogène, la variation d'un lot à l'autre est faible, avec environ 1, 0 µg de pointe d'ARNm chargée par MNP (Extended Data Fig. 7m – p). L'expression des protéines après transfection HeLa avec des LNP ou des LNP redissous à partir du patch de micro-aiguilles a montré que le processus de fabrication de MNP n'affecte pas l'activité des LNP in vitro (données étendues Fig. 7q). Les MNP ont été appliqués sur le coussinet plantaire des souris et l'expression de fLuc a été mesurée par luminescence37. Les LNP avec le lipide 5 ont une expression protéique beaucoup plus élevée en réponse à la dose que cKK-e12 (Fig. 2h), ce qui est prometteur pour une utilisation ultérieure dans l'administration ID.

Pour étudier l'administration ID d'un vaccin à base d'ARNm à base de LNP à l'aide de MNP, nous avons de nouveau mesuré l'expression des protéines in vivo à l'aide d'ARNm de fLuc encapsulé dans des LNP, en comparant cette fois l'application de MNP au coussinet plantaire ID avec l'administration IM d'une quantité équivalente d'ARNm de fLuc dans des LNP (Fig. 2i). L'expression des protéines à 24 h est significativement plus élevée lorsque les LNP sont délivrés via des MNP plutôt que par injection IM. Nous avons également comparé l'expression des protéines lorsque les MNP étaient fabriqués manuellement par rapport à ceux imprimés avec le MVP. Le processus d'impression automatisé n'affecte pas l'activité LNP in vivo (Fig. 2i).

Nous avons évalué les propriétés mécaniques et fonctionnelles des MNP produites avec la combinaison de polymères les plus capables de stabiliser les LNP. Les aiguilles coniques et pyramidales ont été considérées comme des géométries potentiellement viables qui offrent des volumes livrables et un angle de pointe variables (données étendues Fig. 8a et tableau supplémentaire 1), dont il a été démontré qu'elles influencent la pénétration et la dissolution de la peau38. En termes de force maximale (Fig. 3a) et de rigidité (Fig. 3b), les MNP pyramidales en PVP:PVA surpassent les MNP coniques de même composition, et toutes les MNP répondent aux exigences minimales pour percer la peau39. Pour les deux géométries, la ponction de peau de porc ex vivo (Fig. 3c) a été évaluée par histologie et la dissolution des micro-aiguilles a été évaluée par analyse d'image par microscopie optique (Fig. 3d, e et Données étendues Fig. 8b). Bien que les deux géométries puissent accéder au derme, 36 % du volume de la micro-aiguille pyramidale s'est dissous en 10 minutes, contre seulement 8 % du volume de la micro-aiguille conique, ce qui permet une plus grande administration de vaccin, potentiellement en raison de leur angle de pointe plus petit et plus net40. Les MNP pyramidaux ont donc été utilisés pour toutes les expériences suivantes. L'augmentation de la fraction de PVP (données étendues Fig. 8c – e) et de LNP (données étendues Fig. 8f) dans le mélange peut être utilisée pour augmenter le volume dissous.

a, b, les MNP pyramidaux fabriqués à partir de PVP:PVA sont plus rigides (a) et plus résistants (b) que les MNP coniques de taille similaire (n = 10 échantillons indépendants). Tests t bilatéraux non appariés. c, les MNP coniques et pyramidaux sont capables de pénétrer (flèches noires) l'épiderme (e) et d'accéder au derme (d) pour la délivrance de l'identification. d, e, les MNP pyramidaux se dissolvent beaucoup plus rapidement que les MNP coniques en utilisant l'imagerie optique e avant et après l'application (n = 3 échantillons indépendants). Tests t bilatéraux non appariés. f, les GMT sont similaires entre IM et MNP pour l'ARNm du SARS-CoV-2 RBD (n = 5 échantillons biologiquement indépendants). ANOVA bidirectionnelle ordinaire (test de comparaisons multiples de Sidak). g, Titres d'IgG de protéine anti-RBD jusqu'à la semaine 11, montrant les différentes cinétiques des réponses humorales entre l'administration de MNP et IM et des réponses similaires pour l'ARNm du SARS-CoV-2 RBD (n = 5 échantillons biologiquement indépendants). h, Réponses du test de liaison anti-RBD sérique par électrochimioluminescence pour les variants du SRAS-CoV-2 montrant des réponses similaires pour l'IM et le MNP avec l'ARNm du SRAS-CoV-2 RBD (n = 5 échantillons biologiquement indépendants). ANOVA bidirectionnelle ordinaire (test de comparaisons multiples de Sidak). i, PVP:PVA stabilise les ARNm-LNP dans les MNP pour une expression élevée des protéines après 6 mois de stockage à température ambiante (n = 5 échantillons biologiquement indépendants). Chaque ensemble de données est tracé avec un ajustement linéaire et l'intervalle de confiance à 95 % est ombré. j, relation de conception pour répondre aux exigences de dosage chez l'homme pour les vaccins à ARNm courants, illustrant la relation entre le volume de micro-aiguille unique, les micro-aiguilles par MNP et la dose administrée dans un seul MNP. Les flèches noires indiquent la taille (en microaiguilles par MNP) où une dose humaine d'ARNm est satisfaite pour le volume constant de microaiguille unique utilisé dans ces études. Les données représentent la moyenne ± sd (a, b, d) ou la moyenne ± sem (f–i). Les valeurs P sont représentées par : *P ≤ 0,05 ; **P ≤ 0,01 ; ***P ≤ 0,001 ; ****P ≤ 0,0001. MPa, mégapascal ; N, Newton ; NS, non significatif.

Pour développer un vaccin SARS-CoV-2 à administrer par MNP, nous avons utilisé un ARNm codant pour le RBD, modifié avec un motif de trimérisation T4, similaire à la construction du vaccin BNT162b1 (Extended Data Fig. 9a)41. Avant le chargement en deux étapes, les LNP contenant l'ARNm du SRAS-CoV-2 ont été dialysés dans de l'eau et concentrés par filtration centrifuge pour augmenter la capacité de chargement des MNP (Extended Data Fig. 9b,c)42. Pour les LNP, l'efficacité de chargement a également été augmentée en créant des MNP plus petits, ce qui limite l'effet Marangoni à la zone couverte par les micro-aiguilles au lieu du périmètre du patch (Extended Data Fig. 9d, e). Sinon, les MNP ont été fabriqués selon le chargement en deux étapes décrit dans les Fig. 1 et 2, en utilisant PVP:PVA 1:1 à un rapport de masse de 0,32 (mg µg -1) pour stabiliser les LNP et le lipide ionisable Lipid 5 afin de maximiser l'expression intradermique des protéines. Nous avons utilisé des cellules HEK pour confirmer l'expression des vecteurs à base d'ARNm du SARS-CoV-2 (Extended Data Fig. 9f).

Sur la base de rapports précédents, nous avons utilisé un modèle de souris pour évaluer l'immunogénicité du vaccin contre le SRAS-CoV-243. Les vaccins ont été administrés à une dose de 6 μg d'ARNm encapsulé (données étendues Fig. 9g – i) via MNP au coussinet plantaire de souris C57BL / 6, et un rappel de MNP a été administré 28 jours plus tard (données étendues Fig. 10a). En tant que contrôle, une suspension d'ARNm-LNP à une dose d'ARNm de 10 μg a été administrée par injection IM au membre postérieur selon le même schéma. Le sérum a été collecté toutes les 2 semaines et analysé pour la liaison des titres d'IgG anti-RBD. Trois semaines après le rappel, nous avons mesuré des titres moyens géométriques similaires (GMT) entre IM et MNP pour le vaccin à ARNm RBD (Fig. 3f). Les réponses post-prime sont inférieures à celles rapportées pour les vaccins SARS-CoV-2 mRNA-LNP sous licence dans un modèle C57BL/6, qui utilisent différents ARNm et lipides, mais les réponses post-boost sont similaires43,44.

Bien que toutes les souris recevant les ARNm-LNP produisent finalement des GMT élevés, celles qui les reçoivent IM répondent en 1 semaine au rappel, tandis que celles qui les reçoivent via MNP répondent en 3 semaines au rappel (ARNm RBD; Fig. 3g). Nous avons également observé que la cinétique d'expression de FLuc après l'administration de MNP est plus lente que l'administration IM (Extended Data Fig. 10b). Ceci est attendu étant donné que les ARNm-LNP se dissolvent d'une matrice solide dans la peau via MNP, mais un retard dans l'expression des protéines peut aider à expliquer le retard de la réponse immunitaire par rapport au dosage de la suspension liquide. Compte tenu des MGT de pointe légèrement inférieures, mais similaires (Fig. 3f) et de leurs corrélats de protection contre l'infection par le SRAS-CoV-2, les MNP d'ARNm RBD ont néanmoins produit une réponse immunitaire robuste dans un délai raisonnable après l'administration45. Nous avons utilisé un test d'électrochimiluminescence multiplexé pour étudier les réponses de liaison anti-RBD sériques aux variants de la protéine S du SRAS-CoV-2 avec différentes mutations d'intérêt pour démontrer l'étendue de la protection offerte par le vaccin MNP (Fig. 3h).

Nous avons comparé le mélange PVP: PVA qui a été développé pour la livraison d'ARNm-LNP par micro-aiguille à une suspension conventionnelle d'ARNm-LNP administrée IM à la même dose, en utilisant l'ARNm de fLuc comme modèle pour l'expression des protéines chez la souris. Les deux ont été conservés à température ambiante et à 4 °C et évalués 1 mois, 3 mois et 6 mois plus tard in vivo. Bien que la puissance de la suspension IM diminue sur 6 mois, les MNP produisent une luminescence constamment élevée sur toute la période de stockage (Fig. 3i), même lorsqu'elles sont stockées à température ambiante. Les MNP maintiennent également les ARNm-LNP stables lorsqu'ils sont stockés à 37 ° C pendant 1 mois, ce qui correspond au temps de stockage entre l'amorçage et le rappel (Extended Data Fig. 10c). Dans une étude similaire, les MNP d'ARNm RBD sont immunogènes après au moins 3 mois de stockage à température ambiante et à 4 ° C (données étendues Fig. 10d), lorsqu'ils sont utilisés comme rappel pour des souris BALB / c amorcées avec une suspension d'ARNm-LNP.

L'administration d'une dose suffisante de vaccin LNP avec des MNP est difficile en raison de la masse de polymère nécessaire pour stabiliser les LNP. En utilisant le volume de l'aiguille et l'efficacité de chargement des MNP à partir de l'étude des pics de titres anti-RBD, nous avons conçu un modèle (Fig. 3j et note supplémentaire 4) qui prédit la combinaison du volume et du nombre de micro-aiguilles nécessaires pour administrer les doses complètes de vaccin Moderna (ARNm-1273) ou Pfizer-BioNTech (BNT162b1) COVID-19. Le modèle prédit que 360 ​​et 108 des micro-aiguilles pyramidales et de la formulation étudiées délivreraient la dose complète des vaccins Moderna et Pfizer-BioNTech, respectivement. Les MNP contenant une dose suffisante mesurent moins de 2 cm de diamètre.

Bien que l'ampleur des réponses humorales soit similaire, nous avons observé des différences intéressantes entre l'administration IM de la suspension d'ARNm-LNP et l'administration ID d'ARNm-LNP à l'aide de MNP. Les ARNm-LNP incorporant le lipide 5 ont surpassé ceux avec cKK-E12 en termes d'expression de protéines (Fig. 2h), ce qui suggère que les MNP peuvent être sensibles à la composition lipidique ionisable. Les lipides ionisables régissent l'expression et le ciblage des protéines et ont été optimisés pour divers organes et voies d'administration34,35,46,47. Les réponses humorales développent également une IM plus rapide (Fig. 3g). Des recherches antérieures sur les vaccins à base de micro-aiguilles suggèrent un lien entre la méthode d'administration et la cinétique de la réponse humorale48,49. Cela peut refléter la dissolution plus lente de la matrice MNP (Extended Data Fig. 10b) ou des différences fondamentales entre l'administration ID et IM. Ces différences mettent en évidence les opportunités d'étudier et de concevoir plus avant la puissance des ARNm-LNP délivrés par les MNP. De plus, les constructions d'ARNm RBD peuvent justifier une étude plus approfondie en tant que cible pour les vaccins avec une stabilité accrue50.

Les MNP contenant des ARNm-LNP offrent de nouvelles opportunités pour rationaliser l'administration des vaccins et améliorer l'efficacité des vaccins. L'administration ID de virus atténués, de particules pseudo-virales et d'autres vaccins peut permettre une économie de dose par rapport aux voies IM ou sous-cutanées51,52. La livraison ID de vaccins a été recommandée lors d'une réunion du Groupe consultatif stratégique d'experts de l'Organisation mondiale de la santé comme moyen de réduire le coût du vaccin antipoliomyélitique, et un vaccin ADN délivré ID via un injecteur à jet a été autorisé pour une utilisation d'urgence en Inde53,54. Des vaccins stables à température ambiante faciliteraient grandement le déploiement dans les pays en développement, où la chaîne d'approvisionnement nécessaire au transport par le froid peut être inadéquate. Ils permettraient également de stocker les vaccins de manière rentable en vue d'une éventuelle épidémie55. Le déploiement des vaccins COVID-19 en particulier a été entravé par une faible durée de conservation et la dépendance à l'égard des systèmes de stockage et de transport de la chaîne du froid. Jusqu'à présent, à notre connaissance, les vaccins thermostables à ARNm-LNP n'ont pas été développés33,56, peut-être en raison de leur nature nanoparticulaire (par exemple, une surface très élevée) et de leur tendance à s'agréger de manière irréversible, ce qui les rend exceptionnellement difficiles à stabiliser dans une formulation sèche33,57,58,59.

Nous montrons que les vaccins MNP imprimés par le MVP peuvent être conservés à température ambiante et utilisés pour les immunisations des mois après leur fabrication. En revanche, certains vaccins à ARNm actuels doivent être conservés entre -60 ° C et -80 ° C pour un stockage à long terme et à 4 ° C pour un stockage à court terme. Les données de modélisation suggèrent qu'une dose humaine de vaccin ARNm-LNP COVID-19 peut être formulée dans un patch à micro-aiguilles de 2 cm carrés (Fig. 3j). Cela suppose que l'espacement aiguille à aiguille est maintenu à mesure que la taille du patch augmente, mais, pour une éventuelle traduction, la pénétration cutanée et la dissolution de l'aiguille d'un patch plus grand doivent être évaluées. Une ingénierie supplémentaire du MVP sera nécessaire pour développer un processus de fabrication de micro-aiguilles de bout en bout pour une application chez l'homme, y compris une enceinte aseptique pour réduire la charge microbienne et une étape d'emballage intégrée60,61. Nous pensons que le dispositif pourrait être facilement adapté à n'importe quel vaccin à ARNm pour des maladies d'intérêt dans des régions spécifiques et dimensionné en fonction de l'échelle souhaitée de production de vaccins MNP.

Le MVP a été conçu avec l'exigence d'intégrer et d'automatiser les fonctions nécessaires pour convertir les ingrédients nécessaires à la fabrication des MNP en MNP finis avec un niveau de compétence minimal de l'opérateur et dans un facteur de forme adapté au transport. La conception résultante comportait trois fonctions principales : le chargement, la distribution et le séchage. Ces trois fonctions ont été organisées dans le MVP (Extended Data Fig. 3f) et ont été programmées pour fonctionner simultanément. Toute la programmation liée à MVP a été implémentée dans le langage de programmation EPSON RC 7.0 SPEL. L'opérateur doit charger les moules, remplir les réservoirs de formulation liquide et de support polymère et décharger les MNP.

Une fonction de fonctionnement clé a été développée de sorte que, pendant l'étape de distribution, la formulation liquide est d'abord distribuée au-dessus du moule du MNP, puis aspirée à l'intérieur de la cavité du moule négatif en utilisant le vide en dessous (ce qui prend environ 15 min), puis l'étape de chargement se déplace vers la station de séchage où son atmosphère est scellée pour accélérer le temps de séchage.

L'étape de distribution se compose d'une pompe à seringue (Harvard PHD 2000) et d'un bras robotique (Epson T3) tenant une paire de buses (aiguilles de calibre 18 pour les solutions de colorant, calibre 25 pour l'impression de vaccins) reliées par un tube à la pompe à seringue. Le mouvement du bras robotique a été programmé pour être synchronisé avec la pompe à seringue. Le mouvement du bras robotique/pompe a été optimisé pour maximiser la couverture du moule MNP par la formulation liquide. Un intervalle de temps de distribution a été imposé entre chacun des deux MNP adjacents pour minimiser les gouttes entre les patchs et les déchets de vaccins.

Les deux processus étaient basés sur différentes séquences d'application de vide sur des moules PDMS et de distribution de la solution de polymère (chargée de colorant ou d'agents biologiques), suivie d'un séchage sous vide. Dans le premier processus (dégazage), le vide a d'abord été appliqué sur des moules PDMS vides, suivi de la distribution d'une solution de polymère dans un délai spécifique (~ 7 min) juste après l'application du vide, pour finalement sécher la solution de polymère sous vide. Le dégazage sous vide a facilité la diffusion de la solution de polymère dans les cavités des micro-aiguilles du moule PDMS (données étendues Fig. 1b et vidéo supplémentaire 1). Dans la deuxième approche, une solution de polymère a été distribuée sur le moule PDMS, et le vide a ensuite été appliqué à la fois par le dessous et par le dessus des feuilles (données étendues Fig. 1a et vidéo supplémentaire 2) pour induire la diffusion du polymère mais également accélérer le temps de séchage sans formation de bulles. Lors du séchage de la solution sous vide, il est important de maintenir le gradient de pression à travers le moule PDMS en maintenant une pression négative plus élevée sous la feuille PDMS. Ce faisant, l'air dissous dans la solution polymère-vaccin est entraîné vers le bas (vers la chambre à vide sous le moule PDMS), ce qui évite la formation de bulles pendant le séchage. En raison de la simplicité de l'automatisation, la deuxième approche a ensuite été implémentée dans l'appareil.

L'étape de chargement était un réseau 10 × 10 de moules MNP sur mesure, qui a été utilisé pour appliquer un vide (-1 bar) sous les feuilles de PDMS. L'étage de chargement était fixé sur une platine mobile mono-axe (Thorlabs) permettant le transfert entre le poste de chargement et le poste de séchage. Avant de distribuer la formulation, l'alignement de la station de chargement avec la station de distribution a été calibré.

L'étape de séchage était une chambre à vide sur mesure qui se déplaçait verticalement via une étape de mouvement à axe unique (Thorlabs). Le couvre-chef comprenait une connexion à vide ainsi qu'un sac déshydratant (données étendues Fig. 3c). Le vide a été réglé à -0,6 bar pour accélérer le séchage. Une seule pompe à vide a été utilisée pour les étapes de chargement et de séchage. La pompe à vide était directement connectée à l'étage de chargement et un contrôleur de pression était utilisé pour réduire le vide à -0,6 bar dans le couvre-chef. Le vide inférieur dans le couvercle par rapport à l'intérieur de l'étape de chargement a maintenu un gradient de pression négatif dans la feuille de moules PDMS, évitant la formation de bulles dans les solutions MNP. De plus, le contrôleur de pression a été utilisé pour ramener automatiquement l'étape de séchage à la pression atmosphérique après séchage et libérer la chambre à vide de l'étape de chargement.

Des patchs (n = 100) ont été distribués et séchés avec le MVP pour étudier l'effet de la formulation liquide sur la couverture des patchs causée par différents schémas de séchage sur les MNP individuels. La formulation liquide comprenait une formulation polymère (PVP, PVA, PVP:PVA 1:1) dissoute à 20 % (p/p) dans du PBS et mélangée avec un colorant. La couverture du patch a été définie comme le nombre de micro-aiguilles formées avec succès après séchage divisé par le nombre total de patchs fabricables (100). La couverture du patch a été quantifiée individuellement pour chaque patch sous un microscope optique pour chaque formulation. La zone de chute et la circularité ont été quantifiées à l'aide d'une analyse d'image après imagerie.

Une approche de distribution en deux étapes a été suivie pour le chargement des vaccins et autres cargaisons biologiques. Dans la première étape, la solution de vaccin a été aspirée dans le tube de distribution à travers les aiguilles de distribution (calibre 25, BD Biosciences). La formulation liquide dans la première étape était composée d'une certaine concentration de l'agent biologique mélangé avec PVP:PVA 1:1, 4% (p/p). Environ 36 ± 6 µl de solution de vaccin (ou d'autres cargaisons) ont ensuite été distribués à l'aide d'une paire de seringues de 1 ml (BD Biosciences) au centre des moules MNP sur le plateau de distribution. Un intervalle de temps de 9 s a été imposé entre la distribution de chacun des deux MNP adjacents afin de minimiser les déchets de vaccins lors du transfert du robot distributeur d'un moule à l'autre. La solution de support (PVP:PVA 1:1, 20 % (p/p)) a été aspirée directement dans une nouvelle seringue de distribution (de la taille de 10 ml, BD Biosciences). Une quantité de 48 ± 6 µl de la solution de support a été distribuée dans la deuxième étape juste au-dessus des taches de vaccin précédemment distribuées (séchées). Avant et après chaque distribution, les aiguilles et les tubes ont été lavés avec de l'éthanol (70%) puis de l'eau stérile. Dans certaines expériences, une paire de cargaisons a été co-distribuée de sorte que chaque seringue/aiguille distribue une cargaison différente. La même procédure de chargement/distribution que dans la mono-distribution a été suivie dans ce cas, sauf que chaque seringue a été chargée avec une cargaison différente.

SolidWorks 2021 (Dassault Systèmes) a été utilisé pour les illustrations 3D du MVP, du bras robotique, de la station de distribution, des appareils à vide, de la chambre à pression négative, du conteneur d'environnement stérile, du séchoir, de la bande transporteuse et de la station de démoulage automatique des patchs à micro-aiguilles. Le dessin du bras robotique Epson T3 a été directement téléchargé depuis le site officiel d'Epson. Les modèles de traceur XYZ, de séchoir et de bande transporteuse ont été téléchargés à partir de GrabCAD. Toutes les autres pièces ont été conçues sur mesure en référence aux dimensions réelles des pièces prototypes.

Une approche de conception d'expériences (DOE) a été suivie pour étudier systématiquement l'effet de divers paramètres de conception sur la taille collective des gouttes, comme la réponse de sortie, distribuée sur un réseau PDMS individuel à partir de la buse robotique (aiguille). À cette fin, un plan d'expérience en réseau orthogonal L18 (Taguchi DOE) a été construit dans un logiciel (Minitab). L'effet des paramètres de conception suivants a été étudié : (1) fixation d'un filtre de 0,2 µm à la buse, (2) jauge d'aiguille, (3) hauteur de distribution, (4) débit de distribution et (5) viscosité du polymère en fonction de la composition du polymère. La zone de goutte projetée des gouttes totales à la fin de chaque distribution a été quantifiée à l'aide du logiciel ImageJ. Les résultats (n = 3–5) ont été analysés dans Minitab pour trouver la réponse moyenne de la zone de chute en fonction de la modification de ces paramètres. Une illustration schématique de la configuration expérimentale est présentée dans les données étendues de la figure 3g. Le volume total distribué a été considéré comme constant et égal à 200 µl. Différents débits ont été obtenus en maintenant le volume distribué total constant (200 µl) mais en faisant varier la durée de distribution.

Les MNP ont été imprimés à l'aide du MVP automatisé et imagés avec un microscope optique pour déterminer si les micro-aiguilles étaient pleine longueur et pointues (n = 30). L'analyse d'image a été utilisée pour estimer la hauteur de l'aiguille.

La microscopie électronique à balayage (SEM) a été utilisée pour imager les microaiguilles fabriquées. Les échantillons ont d'abord été recouverts d'une fine couche d'Au/Pd à l'aide d'un système de pulvérisation Hummer 6.2 (ANATECH), puis imagés à l'aide d'un SEM JSM-5600LV (JEOL) avec une tension d'accélération de 5 à 10 kV.

Des positifs MNP en acier ont été utilisés pour générer des moules négatifs en PDMS (Sylgard 184, Dow Corning), qui ont été mélangés selon les instructions du fabricant et durcis pendant la nuit à 60 ° C. Pour créer des positifs MNP supplémentaires, l'adhésif optique Norland 61 durcissable aux UV a été rempli dans les moules négatifs PDMS à l'aide d'une centrifugeuse à 3 234 g pendant 1 min, placé dans un four à durcissement UV à température ambiante pendant 20 min et retiré manuellement.

Pour créer un plateau de moules négatifs, les positifs MNP ont d'abord été alignés à l'aide d'une grille acrylique 5 × 5 découpée au laser. Ensuite, Norland Optical Adhesive 61 a été versé entre les réplicats individuels de résine positive, durci aux UV à température ambiante pendant 20 min, puis maintenu à 60 ° C pendant la nuit. Le plateau résultant de MNP positifs 5 × 5 espacés uniformément (données étendues Fig. 3d) a été utilisé pour fabriquer une feuille PDMS 5 × 5 de moules négatifs (données étendues Fig. 3e). Le PDMS a été utilisé pour recouvrir les positifs en résine alignés et créer une couche supplémentaire de 1 mm de PDMS au-dessus des positifs. La feuille a été nivelée, durcie pendant une nuit à 60 ° C et retirée à l'aide d'isopropanol pour aider à séparer le négatif du positif.

Les MNP ont été fabriqués en chargeant et en séchant 200 µl d'une solution à 20 % p/p de PVP, PVA ou PVP:PVA dans un moule PDMS. Lorsque le colorant, les LNP, l'ADN ou la protéine ont été chargés dans le MNP, une procédure de chargement en deux étapes a été utilisée. Tout d'abord, 200 µl d'une solution dans de l'eau déionisée (DI) ou du PBS contenant 0,8 mg, 1,6 mg, 2 mg ou 8 mg de PVP:PVA et diverses quantités de LNP (exprimées en masse d'ARNm encapsulé), de protéines ou d'ADN ont été chargées et séchées. Ensuite, un volume variable de PVP:PVA 20 % w/w dans de l'eau DI ou du PBS a été utilisé pour amener la masse totale de MNP à 40 mg de PVP:PVA. Cette solution de polymère a été chargée et séchée pour créer un mince support polymère. Tous les MNP utilisés dans les études in vivo ont été fabriqués à l'aide d'une distribution manuelle, sauf indication contraire. Tous les MNP chargés de LNP, d'ADN ou de protéines ont été fabriqués en appliquant un vide à travers le moule en utilisant le modèle avec des lignes à une pression manométrique de -1 bar et en appliquant un vide dans la chambre de séchage à une pression manométrique de -0,6 bar.

Pour la méthode de fabrication en une étape, les 40 mg de PVP:PVA ont été mélangés avec diverses quantités de protéines et ajoutés en une seule étape.

Le temps nécessaire pour charger l'encre dans le moule négatif PDMS a été évalué en enregistrant le chargement avec un microscope électronique (n = 3). Le microscope a été placé sur le côté du moule PMDS et focalisé sur les microaiguilles à travers le PDMS transparent.

La solution de polymère a été chargée dans des moules PDMS qui ont été dégazés sous diverses valeurs de vide de 0 à -0,5 bar de pression manométrique pendant diverses durées. Le temps écoulé entre le dégazage et le chargement variait de 5 à 10 min à 1 h. Les MNP ont ensuite été séchés et retirés du moule PDMS. Des images optiques de la solution polymère-colorant se déplaçant dans le moule PDMS ont été acquises 0 min, 2 min, 5 min et 10 min après l'ajout de la solution dans le moule. À partir de ces images, la hauteur de l'aiguille a été estimée à l'aide d'une analyse d'image.

Les solutions de polymères (n = 1) ont été caractérisées à l'aide d'un rhéomètre TA Instruments Discovery HR-2 utilisant une plaque parallèle de 40 mm et une rampe de vitesse de cisaillement de 0,01 s-1 à 5 000 s-1.

Les aiguilles d'un MNP chargé avec 50 µg, 100 µg ou 200 µg de BSA et 0,8 mg, 4 mg ou 8 mg de PVP:PVA (pour le chargement de la pointe en deux étapes) ont été coupées et dissoutes dans de l'eau DI (n = 6). Un dosage de l'acide bicinchoninique (BCA) (Thermo Fisher Scientific) a été utilisé pour quantifier la charge protéique en utilisant la procédure standard pour une plaque à 96 puits. Un standard interne de PVP et PVA a été ajouté à la courbe d'étalonnage pour tenir compte de leur interférence. La quantité de PVP et de PVA ajoutée à la courbe d'étalonnage a été calculée en fonction du volume d'aiguille (0,08 mm3), d'une densité de 1,2 g/cm3 et du nombre d'aiguilles utilisées pour la quantification de BSA (ajusté à la dilution).

Pour la comparaison de l'efficacité de chargement entre la fabrication manuelle et automatisée, des aiguilles d'un MNP chargé avec 100 µg d'ADN et 1,6 mg de PVP:PVA (chargement de pointe en deux étapes) ont été coupées et dissoutes dans du tampon Tris-EDTA (TE) (n = 8). L'ADN a été quantifié par absorption UV à 260 nm et 280 nm à l'aide d'un NanoDrop. Étant donné que le PVP absorbe également dans la plage UV, la même quantité de PVP a été ajoutée à la courbe d'étalonnage pour tenir compte de sa contribution. La quantité de PVP à ajouter a été calculée de la même manière que celle décrite dans la quantification des protéines et en supposant un rapport PVP à PVA de 1: 1. Ceci a été répété pour la carte thermique de la position du plateau et le calcul de l'efficacité de chargement avec de l'ADN, mais 10 µg d'ADN et 2 mg de PVP:PVA ont été utilisés par patch.

Des ARNm purifiés ont été obtenus avec une coiffe CleanCap AG, une substitution complète de N1-méthyl-pseudouridine et une queue polyadénylée (120 A) (TriLink BioTechnologies). Divers lipides de haute pureté ont été utilisés pour la synthèse de LNP, notamment le 3,6-bis({4-[bis(2-hydroxydodécyl)amino]butyl})pipérazine-2,5-dione (cKK-E12, Organix), l'heptadécane-9-yl 8-((2-hydroxyéthyl)(8-nonyloxy)-8-oxoctyl)amino)octanoate (Lipid 5, Organix), le 1-2-dioléoyl-sn -glycéro-3-phosphoéthanolamine (DOPE, Avanti), cholestérol (Sigma-Aldrich) et 1-2-dimyristoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[méthoxy(polyéthylène glycol)-2000] (sel d'ammonium) (C14-PEG2000, Avanti). Les TNL ont été préparés en utilisant les procédures décrites précédemment34,35,36. Les lipides ont été dissous dans de l'éthanol selon un rapport molaire de 35:16:46,5:2,5 cKK-E12:DOPE:cholestérol:C14-PEG2000 ou 38,4:12,3:47,4:1,9 Lipid 5:DOPE:cholestorol:C14-PEG2000 lors de l'utilisation de cKK-E12 ou Lipid 5 comme lipide ionisable, respectivement. Pour préparer les LNP, la solution éthanoïque a été rapidement ajoutée et mélangée à une solution d'ARNm tamponnée avec du citrate à pH 3 à un rapport volumique de 3: 1 (aqueux: éthanol). Lors de l'utilisation de cKKe12, le rapport pondéral lipide ionisable sur ARNm a été fixé à 10 et la concentration finale d'ARNm était de 0, 1 mg ml-1. Lors de l'utilisation du lipide 5, le rapport pondéral lipide ionisable sur ARNm a été fixé à 5 et la concentration finale d'ARNm était de 0, 135 mg ml-1. Tous les acides nucléiques ont été stockés à -80 ° C et laissés décongeler sur de la glace avant utilisation. Les LNP ont ensuite été dialysés pendant au moins 2 h dans du PBS à 4 ° C dans une cassette de seuil de poids moléculaire de 20 000 (MWCO)34. Pour les LNP dans de l'eau DI, la solution a été dialysée contre de l'eau DI pendant un minimum supplémentaire de 2 h à 4 ° C. Au besoin, les LNP ont été concentrés sur un filtre Amicon par centrifugation à 3 000 g42. Toutes les solutions ont été conservées à 4 °C et utilisées en 1 semaine.

La concentration d'ARNm et l'efficacité d'encapsulation dans les LNP ont été estimées avec un test Quant-iT RiboGreen (Thermo Fisher Scientific) en utilisant une procédure modifiée décrite ailleurs (n = 3 par lot)34. En bref, les LNP ont été dilués dans du TE ou du TE mélangé avec du tampon Triton X-100 (TX). Ensuite, le test Quant-iT RiboGreen a été utilisé pour quantifier l'ARNm non encapsulé (lorsqu'il est dilué avec du TE) et la concentration totale d'ARNm (lorsqu'il est dilué avec du TX). Pour la taille, les LNP ont été dilués 200 fois dans du PBS et caractérisés à l'aide d'un Zetasizer Nano-NS (Malvern Instruments). Lors de la mesure de la charge d'ARNm dans les MNP, les micro-aiguilles ont été coupées et dissoutes dans TE et TX. Lors de la mesure de l'ARNm chargé dans le support MNP, les microaiguilles ont été coupées et le MNP restant a été dissous dans TE et TX. La soustraction de l'ARNm non encapsulé de l'ARNm total a donné la concentration d'ARNm encapsulé.

Les polymères ont été dissous dans du PBS ou de l'eau DI à une concentration allant de 10 % à 30 % p/p selon leur solubilité (n = 4). Ces solutions ont ensuite été pesées et mélangées avec une suspension de LNP pour atteindre le rapport de masse polymère/ARNm approprié. Le mélange d'encres a été immédiatement séché dans un tube LoBind Eppendorf dans un dessiccateur sous un vide de -0,5 bar. Après 24 h de séchage, la pastille d'encre a été redissoute dans du PBS et incubée pendant 10 min à 37 °C. Du PBS a été utilisé pour ajuster le volume de sorte que 15 µl d'encre dissoute contiennent 50 ng d'ARNm encapsulé. Ce mélange a été utilisé pour transfecter des cellules. Le lipide ionisable utilisé était cKK-E12.

Pour l'évaluation in vitro des MNP chargés de LNP, quatre MNP ont été fabriqués en utilisant le chargement en deux étapes, 10 µg d'ARNm et 8 mg de PVP:PVA pour le chargement de la pointe. Deux MNP ont été utilisés pour quantifier le chargement de la pointe LNP, et deux MNP ont été utilisés pour transfecter des cellules HeLa. Les aiguilles ont été coupées et dissoutes dans 1 ml de tampon TE pour la quantification de l'ARN et dans 1 ml de DMEM pour la transfection cellulaire. La procédure décrite dans la synthèse de LNP a été utilisée pour quantifier l'ARNm, et les cellules HeLa ont été transfectées comme décrit ci-dessous. Le lipide ionisable utilisé était le lipide 5.

Les cellules HeLa ont été cultivées dans du DMEM à haute teneur en glucose avec du rouge de phénol (Invitrogen) complété par 10 % de FBS (Invitrogen) et 1 % d'antibiotique (Invitrogen). Ensuite, 10 000 cellules ont été ensemencées dans des puits d'une plaque blanche à 96 puits dans un milieu de croissance complet. Vingt heures après l'ensemencement, 15 µl de LNP frais ou de formulation dissoute, ou 50 µl de LNP frais ou de MNP dissous, ont été ajoutés au milieu de croissance. Dans tous les cas, 50 ng d'ARNm encapsulé ont été ajoutés dans chaque puits. Vingt-quatre heures après la transfection, 100 µl de réactif Bright-Glo Luciferase Assay Kit (Promega) ont été ajoutés et la luminescence a été mesurée dans les 2 minutes suivantes à l'aide d'un lecteur de plaques Tecan Infinite 200 PRO.

La viabilité des cellules HeLa a été mesurée en présence de 0,6 mg de formulation de polymère et de 50 ng d'ARNm encapsulé dans des LNP fabriqués avec cKK-e12 comme lipide ionisable. Quinze microlitres d'encre ont été utilisés dans chaque puits. La viabilité cellulaire a été mesurée dans une plaque à 96 puits à l'aide d'un test CKK8 tel que décrit par le fabricant (ab228554).

Le MNP a été fabriqué en utilisant le chargement en deux étapes, en utilisant 10 µg d'ARNm et 8 mg de PVP:PVA dans la première étape. Chacune des 100 aiguilles du MNP a été coupée manuellement à sa base sous un microscope et triée en fonction de sa position sur le tableau. L'ARN a été quantifié de la même manière que décrit dans la section de synthèse de LNP. Le lipide ionisable utilisé était le lipide 5.

Les ARNm-LNP de FLuc ont été utilisés pour tous les échantillons. Les LNP ont été analysés (1) après dialyse au PBS, (2) après concentration à 320 μg ml-1, (3) après dilution à 200 μg ml-1 dans une solution de polymère à 4 % p/p pour former de l'encre vaccinale et (4) après séchage pour former des MNP. Les échantillons ont été dissous dans 20 µl, vortexés pendant 2 s, dilués avec 200 µl supplémentaires et mélangés. Ensuite, 10 µl d'ARNm-LNP reconstitués ont été dilués dans 490 µl d'eau, vortexés pendant 2 s puis analysés par diffusion dynamique de la lumière (DLS) sur un Zetasizer Nano-NS (Malvern Instruments). Les échantillons (n ​​= 5 par groupe) ont été équilibrés pendant 60 s avant la mesure. Trois répétitions techniques ont été réalisées pour chaque échantillon.

Les ARNm-LNP de FLuc ont été utilisés pour tous les échantillons. Les LNP ont été analysés (1) après dialyse au PBS (2), après concentration à 320 μg ml-1 (3), après dilution à 200 μg ml-1 dans une solution de polymère à 4 % p/p pour former de l'encre vaccinale et (4) après séchage pour former des MNP. Les échantillons dissous ont été ajoutés sur les grilles TEM en cuivre revêtues de carbone et buvardés pour éliminer l'excès de solution. Ensuite, les échantillons ont été colorés en utilisant une solution aqueuse d'acide phosphotungstique à 1 % ; la solution de coloration en excès a été éliminée; et les échantillons ont été séchés à température ambiante avant l'imagerie TEM. Pour l'imagerie cryogénique-TEM, les échantillons ont été congelés en plongée à l'aide d'un 930 Gatan Cryoplunge 3. Tous les échantillons ont été imagés à l'aide d'un microscope JEOL 2100 FEG à une tension d'accélération de 200 kV.

Les ARNm-LNP de FLuc ont été utilisés pour tous les échantillons. L'ARNm a été analysé (1) tel que fourni par le fabricant, (2) après synthèse de l'ARNm-LNP et dialyse au PBS, (3) après dilution à 200 μg ml-1 dans une solution de polymère à 4 % p/p pour former de l'encre vaccinale et (4) après séchage pour former des MNP. Ensuite, 2 µl d'échantillons dissous ont été analysés à l'aide d'un Agilent Femto Pulse en utilisant le kit Ultra Sensitivity RNA (FP-1201). Les échantillons ont été préparés en utilisant un tampon TE ou TX.

La teneur en eau des MNP fabriqués à différents moments et étapes de séchage a été quantifiée par analyse thermogravimétrique (TGA) à l'aide d'un analyseur thermogravimétrique Pyris 1 (PerkinElmer) avec une vitesse de chauffage de 20 °C par minute de 50 °C à 600 °C sous flux d'azote (20 ml min-1) (n = 3). La teneur en eau a été évaluée en analysant uniquement les aiguilles des MNP placées dans des casseroles en céramique et non le support. Le taux de séchage a été estimé à l'aide d'une régression linéaire de la teneur en eau mesurée au fil du temps tout au long du processus de séchage. Toutes les analyses ont été réalisées en triple.

Pour les tests de compression, un seul MNP a été monté entre des plateaux de compression (série Instron 2501) et comprimé à une vitesse de 1 mm min-1 à l'aide d'un Instron 5943 avec une cellule de charge de 500 N (n = 10). La force maximale avant la défaillance de la micro-aiguille a été rapportée et la pente de la région linéaire de compression initiale. Le mode de défaillance de la micro-aiguille a été déterminé par imagerie des patchs après le test.

Les MNP ont été appliqués ex vivo sur de la peau de porc excisée à l'aide d'un mini applicateur à ressort (Micropoint Technologies) pendant 2 min, 5 min, 10 min ou 30 min (n = 3). Par la suite, les échantillons de peau ont été fixés dans du formol pendant 48 h puis transférés dans de l'éthanol à 70 % et inclus dans de la paraffine. Les échantillons ont été sectionnés et colorés avec de l'hématoxyline et de l'éosine.

Pour quantifier la dissolution des micro-aiguilles en fonction du temps d'application, des patchs de micro-aiguilles ont été imagés avant et après l'application sur de la peau de porc excisée à l'aide d'un Leica DFC450. Les patchs ont été placés de manière transversale pour l'imagerie à l'aide du logiciel LAS version 4.7. La longueur des micro-aiguilles a été calculée à l'aide d'ImageJ pour au moins 10 micro-aiguilles de chaque patch, et ces mesures ont été effectuées sur trois patchs par point de temps.

Toutes les procédures animales ont été approuvées et exécutées selon les directives du Massachusetts Institute of Technology Committee on Animal Care (1019-061-22). Des souris C57BL/6 femelles âgées de six à huit semaines (Charles River Laboratories) ont été utilisées et surveillées pour leur innocuité (n = 5). Les MNP ont été fabriqués avec des ARNm-LNP codant pour FLuc (L-7010, TriLink BioTechnologies) en utilisant la méthode de chargement en deux étapes décrite ci-dessus. La dose de LNP et la chimie des lipides ionisables ont été variées, en maintenant au moins un rapport de masse polymère:ARNm de 100:1. Deux lipides ionisables préalablement sélectionnés pour les méthodes d'administration d'ARNm IV ou IM ont été étudiés respectivement : cKK-E12 (réf. 34) et Lipid 5 (réf. 35). Les MNP ont été appliqués sur l'un ou l'autre des coussinets plantaires sous anesthésie. Pour dissoudre plus complètement la dose complète de LNP transportée dans un MNP, lorsqu'un réseau 10 × 10 a été appliqué, les MNP ont été divisés en deux moitiés et appliqués consécutivement sur le même coussinet plantaire, pendant 10 min par moitié. Une pression manuelle a été appliquée pendant la première minute, puis le MNP a été fixé au coussinet plantaire à l'aide de ruban adhésif pendant les 9 minutes restantes. En tant que contrôle positif, les LNP ont été administrés au muscle caudal de la cuisse sous forme de suspension de 40 µl dans du PBS à des doses correspondantes. Le coussinet plantaire a été sélectionné parce qu'il a déjà été utilisé pour l'imagerie IVIS de la luminescence après l'application de micro-aiguilles37 et parce qu'il s'agit d'un site bien étudié pour l'administration ID de vaccins, permettant l'isolement du ganglion lymphatique drainant62,63.

Vingt-quatre heures après l'application de MNP, les souris ont été imagées pour la bioluminescence dans un système d'imagerie cinétique IVIS (PerkinElmer). Puis, 15 min avant l'imagerie, les souris ont reçu une injection intrapéritonéale de RediJect D-Luciferin Ultra (PerkinElmer) à 150 mg kg-1. La luminescence a été quantifiée à l'aide du logiciel LivingImage (PerkinElmer). La comparaison entre les résultats de luminescence doit être soigneusement examinée car l'absorption de la lumière au site d'injection, la diffusion et la profondeur de livraison peuvent affecter le signal mesuré à l'aide de l'IVIS. Pour l'expérience de cinétique, l'imagerie a été réalisée à 2 h, 6 h, 24 h, 48 h et 72 h après l'administration.

Au total, 89 000 cellules HEK293 ont été ensemencées par puits d'une lame de culture à quatre puits BioCoat Poly-D-Lysine (354577). Le même milieu de croissance que les cellules HeLa a été utilisé. Vingt-quatre heures après l'ensemencement, les cellules ont été transfectées avec 265 ng d'ARNm par puits à partir d'une suspension de LNP faite avec le lipide 5 et encapsulant l'ARNm codant pour le RBD. Les LNP dissous à partir d'un MNP ont également été utilisés pour démontrer la bioactivité après le chargement dans les MNP. Le même MNP que ceux utilisés dans l'étude de vaccination contre le SRAS-CoV-2 a été utilisé. Les aiguilles ont été coupées, dissoutes dans du DMEM et utilisées pour transfecter des cellules en utilisant la même masse d'ARNm que la suspension LNP témoin. L'ARNm a été quantifié en dissolvant des aiguilles d'un réplicat indépendant du MNP dans du tampon TE et en utilisant la procédure décrite dans la synthèse de LNP (PVP et PVA ont également été ajoutés comme étalons internes à la courbe d'étalonnage d'ARN du RiboGreen). Quarante-huit heures après l'ensemencement, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS à 37°C. Les cellules ont été lavées avec du PBS entre toutes les étapes suivantes. Les cellules ont été laissées s'équilibrer à température ambiante pendant 15 min. Ensuite, 1 ml de solution de fixation Image-iT (Invitrogen) a été ajouté par puits (FB002) et laissé pendant 15 min. Ensuite, 1 ml de tampon de fixation et de perméabilisation intracellulaire eBioscience (Invitrogen) a été ajouté et laissé à incuber pendant 10 min. Ensuite, 1 ml de BSA 1% (w:v) dans du PBS a été ajouté pendant 1 h à température ambiante. Ensuite, 300 µl d'anticorps monoclonal humain recombinant SARS-CoV-2 Spike Protein (RBD) (T01KHu, Thermo Fisher Scientific, 703958) dilué 100 fois dans du PBS ont été ajoutés à chaque puits et laissés à incuber pendant 1 h. PBS-Tween a été utilisé pour laver les cellules. Ensuite, 300 µl d'anticorps secondaire adsorbé croisé anti-humain IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific, A-11013), dilué 400 fois dans du PBS ont été utilisés comme anticorps secondaire et incubés pendant 1 h. Ensuite, 300 µl de coloration Rhodamine-Phalloidin (Invitrogen R415) diluée 400 fois dans BSA 1% ont été utilisés pour l'imagerie du cytosquelette cellulaire et incubés pendant 30 min. Les cellules ont finalement été fixées à l'aide d'une goutte de DAPI ProLong (Invitrogen, P36982). Les cellules ont été imagées sur un microscope confocal (Olympus FV1000).

Toutes les procédures animales ont été approuvées et exécutées selon les directives du Massachusetts Institute of Technology Committee on Animal Care (1019-061-22). Des souris C57BL/6 femelles âgées de six à huit semaines (Charles River Laboratories) ont été utilisées et surveillées pour leur innocuité (n = 5). Les MNP ont été fabriqués avec des ARNm-LNP humains optimisés en codons codant pour SARS-CoV-2 RBD et un motif de trimérisation T4, en utilisant la méthode de chargement en deux étapes décrite ci-dessus. Des puces MNP plus petites ont été fabriquées contenant 1,5 µg d'ARNm encapsulé, ce qui a été vérifié par quantification de l'ARNm. Quatre MNP avec environ 12 microaiguilles ont été appliqués sur les coussinets plantaires gauche et droit de souris sous anesthésie, avec un temps d'application de 10 minutes pour chacun, pour une dose totale d'ARNm encapsulé de 6,0 µg par souris. Une pression manuelle a été appliquée pendant la première minute, puis le MNP a été fixé au coussinet plantaire à l'aide de ruban adhésif pendant les 9 minutes restantes. En tant que contrôle positif, les LNP ont été administrés au muscle caudal droit de la cuisse sous forme de suspension de 40 µl dans du PBS à 10,0 µg d'ARNm encapsulé par souris.

Toutes les procédures animales ont été approuvées et exécutées selon les directives du Massachusetts Institute of Technology Committee on Animal Care (1019-061-22). Les MNP ont été fabriqués avec des LNP d'ARNm FLuc en utilisant la méthode de chargement en deux étapes décrite ci-dessus, à une dose d'ARNm de 1, 0 µg par patch avec un rapport de masse polymère: ARNm de 500: 1. Le lipide 5 a été utilisé comme lipide ionisable. La taille et l'application des MNP sont identiques aux études ci-dessus sur l'expression de fLuc (n = 5). Les MNP ont été stockés dans un conteneur avec un dessicant de silice à différentes températures. En tant que contrôle positif, des flacons scellés de suspension contenant la même quantité d'ARNm de fLuc dans des LNP fabriqués avec le lipide 5 ont été stockés à différentes températures aux côtés des MNP.

Un kit de détection ELISA SARS-CoV-2 Spike S1-RBD a été utilisé (L00845, GenScript). Les plaques ont été recouvertes d'antigène SARS-CoV-2 Spike S1-RBD recombinant purifié. Les plaques ont été incubées avec des dilutions en série de sérums inactivés par la chaleur et incubées à 37°C pendant 30 min. Une dilution au 1/10 000 du conjugué peroxydase de raifort anti-IgG de souris de lapin (Abcam, ab6728) a été utilisée comme anticorps secondaire, et la 3,5,3′,5′-tétraméthylbenzidine (TMB) a été utilisée comme substrat. Les titres de point final interpolés ont été calculés comme la dilution qui émettait une densité optique dépassant 3 × le fond produit par le sérum de souris naïves.

Des plaques ECLA (Meso Scale Discovery SARS-CoV-2 IgG, N05CA-1, Panel 7) ont été conçues et produites avec quatre points d'antigène dans chaque puits. Les antigènes inclus étaient WA1/2020, B.1.1.7, P.1 et B.1.351 S1-RBD. Les plaques ont été bloquées avec 50 µl de solution de BSA à 1 % pendant au moins 30 min à température ambiante sous agitation à 700 tr/min. Pendant le blocage, le sérum a été dilué au 1/5 000 avec du diluant 100 (Meso Scale Discovery). Les plaques ont été lavées avec 150 ul de tampon de lavage et séchées par buvardage, et 50 ul d'échantillons dilués ont été ajoutés en double aux plaques. Les échantillons ont été incubés à température ambiante sous agitation à 700 tr/min pendant 2 h. L'anticorps secondaire a été préparé à l'aide de l'anticorps de détection IgG anti-souris de lapin Jackson ImmunoResearch (315-005-045) conjugué au MSD GOLD SULFO-TAG par la chimie NHS-Ester conformément aux directives du fabricant (R91AO-1). Les plaques ont été à nouveau lavées trois fois et 50 µl d'anticorps de détection d'IgG anti-souris marqués au SULFO dilués à 1 × dans du diluant 100 ont été ajoutés à chaque puits et incubés pendant 1 h avec une agitation à 700 tr/min. Les plaques ont été lavées trois fois; 150 µl de tampon de lecture MSD GOLD B ont été ajoutés à chaque puits ; et les plaques ont été lues sur un MESO Quick-Plex SQ 120. Les titres MSD pour chaque échantillon ont été rapportés en unités lumineuses relatives (RLU), qui ont été calculées comme échantillon moins blanc pour chaque spot et échantillon. La limite de détection a été définie à 500 RLU pour tous les tests.

Les MNP contenant 1,5 μg d'ARNm du SRAS-CoV-2 encapsulé ont été stockés dans un récipient avec un dessicant de silice à différentes températures. En tant que contrôle positif, des flacons scellés de suspension contenant des LNP-ARNm du SRAS-CoV-2 à 200 µg ml-1 ont été stockés à différentes températures aux côtés des MNP. Des souris femelles BALB/c âgées de six à huit semaines (Charles River Laboratories) ont été utilisées et surveillées pour leur innocuité (n = 5). Toutes les souris ont reçu une première dose de 10 µg d'ARNm encapsulé dans des ARNm-LNP administrés au muscle caudal droit de la cuisse sous forme de suspension de 40 µl dans du PBS. Les souris ont ensuite été stimulées avec divers matériaux, y compris des contrôles frais et des patchs ou une suspension stockés pendant 1 mois ou 3 mois. Pour les groupes MNP, comme dans les expériences précédentes, quatre MNP avec 12 microaiguilles ont été appliqués sur les coussinets plantaires gauche et droit de souris anesthésiées, avec un temps d'application de 10 minutes pour chacun, pour une dose totale estimée d'ARNm de 6,0 µg par souris. Pour les groupes IM, 4 μg d'ARNm encapsulé dans des ARNm-LNP ont été administrés au muscle caudal droit de la cuisse sous forme de suspension de 40 μl dans du PBS.

Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide du logiciel GraphPad Prism. Les valeurs P sont représentées par : *P ≤ 0,05 ; **P ≤ 0,01 ; ***P ≤ 0,001 ; ****P ≤ 0,0001.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les ensembles de données générés et analysés au cours de ces études sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable. La séquence RBD utilisée pour cette étude est disponible chez GenBank (OP839194).

Les codes utilisés pour la modélisation du débit et la programmation des appareils sont disponibles dans un référentiel Zenodo public (https://doi.org/10.5281/zenodo.7735167).

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Maloy, KJ, Donachie, AM, O'Hagan, DT & Mowat, AM Induction de réponses immunitaires muqueuses et systémiques par immunisation avec de l'ovalbumine piégée dans des microparticules de poly(lactide-co-glycolide). Immunologie 81, 661-667 (1994).

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Zhang, YN et al. La taille des nanoparticules influence la rétention et la présentation de l'antigène dans les follicules des ganglions lymphatiques pour l'immunité humorale. Nano Lett. 19, 7226–7235 (2019).

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Nous remercions Meso Scale Discovery pour ses généreux conseils, son assistance et ses réactifs. Nous remercions le Centre de biotechnologie Robert A. Swanson (1969) de l'Institut Koch (RRID : SCR_018674) pour son soutien technique, en particulier le noyau d'histologie, le noyau de matériaux nanotechnologiques, le BioMicroCenter et les installations d'imagerie animale et d'essais précliniques. Nous reconnaissons le laboratoire pour les matériaux d'ingénierie du département de science et d'ingénierie des matériaux du MIT pour son soutien technique. Ce travail a été soutenu, en partie, par le Koch Institute Support (core) Grant P30-CA14051 du National Cancer Institute. Ce travail a également été soutenu par la subvention DHHS/OS/ASPR/BARDA/DRIVe EZ-BAA-18-100-SOL-00018 de la Biomedical Advanced Research and Development Authority (BARDA). AVS est récipiendaire d'une bourse et tient à remercier la Fondation belgo-américaine pour l'éducation (BAEF) et Wallonie-Bruxelles International pour la bourse d'excellence (WBI.World). MK est récipiendaire d'une bourse et tient à remercier la Fondation Bodossaki et la Fondation Onassis. Nous reconnaissons le soutien des National Institutes of Health (T32 AI0073787) à LHT

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Aurélien vander Straeten, Morteza Sarmadi, John L. Daristotle.

Institut David H. Koch pour la recherche intégrative sur le cancer, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, États-Unis

Aurélien vander Straeten, Morteza Sarmadi, John L. Daristotle, Maria Kanelli, Joe Collins, Apurva Pardeshi, Jooli Han, Dhruv Varshney, Behnaz Eshaghi, Johnny Garcia, Timothy A. Forster, Gary Li, Nandita Menon, Shahad K. Alsaiari, Robert Langer et Ana Jaklenec

Center for Virology and Vaccine Research, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, Boston, MA, États-Unis

Lisa H. Tostanoski, Catherine Jacob-Dolan, Olivia C. Powers, Kevin Hall et Dan H. Barouch

Département de génie chimique, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, États-Unis

Sydney L. Pyon, Linzixuan Zhang et Robert Langer

École de médecine de Harvard, Boston, MA, États-Unis

Catherine Jacob-Dolan & Dan H. Barouch

Ragon Institute of MGH, MIT et Harvard, Cambridge, MA, États-Unis

Catherine Jacob-Dolan & Dan H. Barouch

Laboratoire de génie macromoléculaire, Département de génie mécanique et des procédés, ETH Zurich, Zurich, Suisse

Morris Wolf et Mark W.Tibbitt

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Conceptualisation : AVS, MS, JD, MK, JC, AJ et RF Méthodologie : AVS, MS, JD, MK, LT, JC, AP, DV, BE, JG, TF, GL, NM, CJD, SL, LZ, OP, KH, SA et MW Enquête : AVS, MS, JD, MK, LT, JC, AP, DV, BE, JG, TF, GL, NM, SP, CJD, SL , LZ, OP, KH et MW Visualisation : AVS, MS, JD et JH Financement acquisition : AJ, RL, AVS et MK Administration du projet : AVS, JD, JC et AJ Supervision : AJ, RL, DB et MT Rédaction—ébauche originale : AVS, MS et JD Rédaction—révision et édition : AVS, MS, JD, LT, JH, RF, DB, RL et AJ

Correspondance à Robert Langer ou Ana Jaklenec.

Pour une liste des entités avec lesquelles RL est impliqué, rémunéré ou non, voir www.dropbox.com/s/yc3xqb5s8s94v7x/Rev Langer COI.pdf?dl=0. Pour une liste des entités avec lesquelles AJ est impliqué, rémunéré ou non, voir https://www.dropbox.com/s/wre16lh7jr7bvoi/230410%20Jaklenec%20COI.pdf?dl=0. AVS, MS, JD, MK, JC, RL et AJ sont nommés en tant qu'inventeurs sur une demande de brevet en instance (17/903586) liée à la technologie décrite. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Biotechnology remercie les évaluateurs anonymes pour leur contribution à l'évaluation par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Consultant indépendant : Robert Farra.

(a) Chargement dans le moule à micro-aiguilles négatif basé sur la perméabilité à l'air du PDMS suivi du séchage de la solution de polymère. Le vide est appliqué sous la feuille PDMS pour éliminer l'air sous l'encre du vaccin à travers le moule PDMS perméable à l'air. Le séchage est accéléré en appliquant également le vide au-dessus du moule. (b) Chargement dans le moule à micro-aiguilles négatif basé sur la solubilité dans l'air du PDMS suivi du séchage de la solution de polymère. (c) Configurations du dispositif sous vide pour appliquer le vide au fond du moule PDMS. (d) Temps de chargement de la solution de polymère pour le PDMS fabriqué à partir de différents rapports polymère/agent de réticulation (n = 3 échantillons indépendants). Une ANOVA unidirectionnelle ordinaire (test de comparaisons multiples de Sidak) a été utilisée. ( e ) Images de MNP provenant de moules PDMS qui ont été dégazés sous diverses valeurs de vide et chargés avec une solution de polymère. ( f ) Images de MNP où la solution de polymère a été ajoutée au moule PDMS dégazé après 5 à 10 min ou 1 heure. (g–h) Progression de la hauteur de l'aiguille dans le temps après la distribution de la solution de polymère (n = 13–18 aiguilles individuelles). (i – j) Hauteur d'aiguille normalisée à partir d'images après diverses conditions de dégazage (n = 10–18 aiguilles individuelles). ( k ) Viscosité mesurée pour diverses solutions de polymères utilisées dans cette étude ( n = 1). Les données représentent la moyenne ± sd Les valeurs P sont représentées par : *P ≤ 0,05 ; **P ≤ 0,01 ; ***P ≤ 0,001 ; ****P ≤ 0,0001. MPa, mégapascal ; NS, non significatif.

( a ) Images de MNP fabriquées à partir de divers volumes de solution PVP:PVA à 20% en poids, qui minimisent les déchets de vaccins avec un support ultra-mince. Les solutions PVP:PVA à 20 % p/p ont été colorées avec du cristal violet. ( b - c ) Images d'optimisation du volume de distribution et mesure de la circularité du support séché résultant de diverses formulations de matrices MNP ( n = 1).

(a) Conception CAO des pièces acryliques qui ont été découpées et montées ensemble pour former la station de chargement. Photos de (b) la station de chargement, (c) le capot de la station de séchage, (d) le positif MNP 5 × 5 et (e) la feuille PDMS 5 × 5 des moules MNP négatifs. (f) Une photographie du système MVP avec les caractéristiques annotées. (g) Schéma illustrant le système de distribution et la hauteur de distribution. Effet du débit des paramètres de distribution (h), de la filtration (i), de la taille de l'aiguille (j) et de la hauteur de distribution (k) sur la taille des gouttes résultantes. Toutes les différences sont significatives à (P < 0,01) sauf indication contraire. Une ANOVA unidirectionnelle ordinaire (test de comparaisons multiples de Sidak) a été utilisée (n = 3 MNP par groupe). (l) Une image de 100 MNP distribués et séchés sur un plateau d'impression. Les données représentent la moyenne ± sd *P ≤ 0,05 ; **P ≤ 0,01 ; ***P ≤ 0,001 ; ****P ≤ 0,0001. NS, non significatif.

(a) Schéma des processus utilisés pour (a) le chargement en une étape et (b) le chargement de la pointe en deux étapes. Une solution contenant le vaccin et le polymère est d'abord distribuée à l'aide d'un bras robotique au-dessus du moule PDMS. Simultanément, un vide de -1 bar est appliqué en dessous pour charger la solution dans le moule négatif. Ensuite, la solution est séchée sous atmosphère déshydratante et sous vide de -0,6 bar. Pour le chargement en une étape (a), le vaccin et suffisamment de polymère pour former les pointes et le support sont déposés en une seule étape. Pour le chargement de pointe en deux étapes (b), le vaccin et le polymère sont d'abord déposés uniquement dans les pointes, puis la même procédure est répétée en utilisant uniquement le polymère pour former le support des MNP. ( c ) Caractérisation de micro-aiguilles pointues de pleine longueur correctement formées fabriquées par le MVP automatisé, en pourcentage du nombre total d'aiguilles produites (n = 30 patchs). Les MNP fabriquées avaient en moyenne 37 ± 8 aiguilles par patch. (d) Le débit de distribution est fonction de la hauteur de goutte distribuée et de la taille du patch, tandis que (e) le débit de séchage est fonction du temps de séchage et du nombre d'aiguilles par patch. Les deux débits sont fonction du temps de séchage (f) et de la taille du patch (g). L'étape avec le débit le plus bas détermine le débit global de l'imprimante de vaccins à micro-aiguilles.

(a) Le débit de fabrication automatisée de MNP peut être augmenté en déplaçant des plateaux modulaires de moules MNP vers un séchoir pour accélérer l'étape de séchage du vaccin. L'application sous vide pour remplir le moule à micro-aiguilles peut se produire soit sur le dispositif de transport du moule (au milieu), soit dans le porte-plateau (à droite). (b) Le débit de séchage est présenté en fonction de la longueur du plateau et du nombre de plateaux dans le séchoir vertical. La taille (h) du séchoir a été estimée en supposant une hauteur de plateau unique de 50 mm. Comme pour le dispositif à plateau unique, le temps de séchage est supposé être de 48 h. (c) Les moules PDMS peuvent être prétraités avec une technique de dégazage utilisant une pression négative avant la distribution du vaccin pour un processus de fabrication MNP accéléré. Avec des moules PDMS dégazés, un bras robotisé peut distribuer une solution vaccinale de manière continue. Les moules PDMS entièrement distribués peuvent ensuite être déplacés vers un séchoir à l'aide d'un tapis roulant. L'ensemble de ce processus sera contenu dans une enceinte aseptique pour maintenir la stérilité pendant le traitement. (d – i) Conception pour le démoulage automatisé des patchs. (d) Une fois que les patchs de micro-aiguilles de vaccin sont complètement séchés dans un moule PDMS, (e) un bras robotique apporte un support acrylique avec du ruban adhésif double face. (f) Le bras robotique aligne et attache le support adhésif acrylique à un patch microneedle, (g) et le MNP est retiré du moule PDMS lorsque le bras robotique est soulevé verticalement. (h) La pointe du bras robotique entre entre une fente métallique conçue pour l'élimination des MNP. Lorsque le bras robotique se soulève verticalement, le MNP se détache de la pointe du bras du robot et tombe dans son emballage (i), où le MNP plane pour éviter tout contact direct avec les pointes d'aiguille. Les MNP démoulés sont emballés et stockés dans un environnement stérile et sec jusqu'à leur utilisation.

Comparaison du chargement de la pointe (a) et de l'efficacité du chargement de la pointe (b) en utilisant le processus de fabrication en une ou deux étapes en fonction de la masse de protéines utilisée pour la distribution. ( c ) Comparaison de la masse de polymère (PVP: PVA) utilisée avec la protéine (BSA) lors de la première étape du processus de fabrication en deux étapes. La masse de polymère faible est de 0,8 mg de PVP:PVA tandis que la masse de polymère élevé est de 4 mg et 8 mg de PVP:PVA pour 100 µg et 200 µg de BSA respectivement. Une ANOVA bidirectionnelle ordinaire (test de comparaisons multiples de Sidak) a été utilisée (n = 6 échantillons indépendants). ( d ) Masse relative d'albumine de sérum bovin (BSA) chargée pour trois grands lots différents de MNP, normalisée à la moyenne. Le test de Bartlett (p = 0,006) a révélé que les écarts-types pouvaient être significativement différents, et les tests t bilatéraux entre les groupes ont révélé que les patchs distribués à 30 mm avaient un écart-type significativement différent des deux autres groupes, qui étaient comparables entre eux (n = 50 patchs pour le fait main ; n = 40 patchs pour l'une ou l'autre des hauteurs de distribution étudiées). (e) Efficacité de chargement par patch pour 10 μg d'un vaccin à ADN pour n = 100 MNP fabriqués à l'aide du MVP. Les données représentent la moyenne ± sd Les valeurs P sont représentées par : *P ≤ 0,05 ; **P ≤ 0,01 ; ***P ≤ 0,001 ; ****P ≤ 0,0001. NS, non significatif.

(a) concentration d'ARNm encapsulé, (b) efficacité d'encapsulation d'ARNm et (c) diamètre des LNP fabriqués avec deux lipides ionisables différents (cKK-e12 ou Lipid 5) et encapsulant l'ARNm codant pour fLuc ou RBD (n = 3). ( d ) Viabilité des cellules HeLa mesurée en présence de 0, 6 mg de formulation et de 50 ng d'ARNm encapsulés dans des LNP fabriqués avec cKK-e12 (n = 4 répétitions techniques). (e) Temps de séchage total pour les MNP constitués de différentes formulations de polymères utilisant de l'alcool polyvinylique (PVA) ou de la polyvinylpyrrolidone (PVP10 ou PVP60, 10 kDa ou 60 kDa de poids moléculaire, respectivement). Deux approches de séchage différentes ont été étudiées : séchage sous flux d'azote pendant 10 h avant le vide ou séchage avec déshydratant pendant 24 h avant le vide (n = 1). Les patchs 100% PVP étaient trop fragiles pour être retirés du moule sans se fracturer. ( f ) Rigidité et ( g ) force maximale mesurées lors des tests de compression de MNP chargés d'ARNm-LNP fabriqués à partir de différents polymères. Une ANOVA unidirectionnelle ordinaire (test de comparaisons multiples de Sidak) a été utilisée (n = 5 par groupe). ( h ) diamètre mrna-lnp mesuré par diffusion dynamique de la lumière (dls) immédiatement après synthèse, après concentration, après formulation dans l'encre du vaccin et après séchage pour former la matrice MNP. (n = 3 par groupe). Images représentatives de microscopie électronique à transmission (TEM) et de cryo-TEM pour (i) les ARNm-LNP après synthèse, (j) les ARNm-LNP dans l'encre du vaccin et (k) les ARNm-LNP dans les patchs à micro-aiguilles. ( l ) analyse de fragments d'ARNm à partir d'ARNm-LNP de FLuc, d'ARNm d'encre de vaccin et d'ARNm de MNP, caractérisés par électrophorèse capillaire. ( m ) Distribution d'ARNm encapsulé dans les aiguilles d'un patch à micro-aiguilles. (n) Histogramme de chargement d'ARNm encapsulé par aiguille. (o) Chargement d'ARNm encapsulé et (p) efficacité de chargement par patch (n = 2 échantillons indépendants). ( q ) Expression protéique après transfection HeLa avec des LNP (6 répétitions techniques) ou les mêmes LNP redissous à partir du patch microneedle (n = 2 échantillons indépendants, 6 répétitions techniques par MNP). Les données représentent la moyenne ± sd

(a) Dimensions d'une micro-aiguille individuelle utilisée dans les patchs pyramidaux ou coniques à micro-aiguilles. L'espacement entre deux aiguilles adjacentes (pas) est de 1000 µm. ( b ) Imagerie optique représentative de la dissolution de l'aiguille lors de l'application ex vivo sur la peau de porc en fonction du temps pour les MNP de forme pyramidale et conique. ( c - e ) Comparaison entre les micro-aiguilles coniques et pyramidales fabriquées à partir de PVP: PVA 2: 1 et 1: 1, en termes de volume dissous dans la peau de porc ex vivo. Tests t bilatéraux non appariés (n = 23 à 59 aiguilles par groupe). Les données représentent la moyenne ± sd Les valeurs P sont représentées par : *P ≤ 0,05 ; **P ≤ 0,01 ; ***P ≤ 0,001 ; ****P ≤ 0,0001. NS, non significatif.

(a) Schéma de la séquence SARS-CoV-2 RBD des constructions d'ARNm utilisées dans cet article. La séquence signal (SS) est colorée en orange, le domaine RBD est coloré en bleu et le motif de trimérisation T4 est coloré en vert. ( bc ) Les LNP encapsulant l'ARNm qui code pour fLuc ont été mélangés avec divers polymères solubles dans l'eau et séchés. Les LNP ont été dialysés dans du PBS ou de l'eau DI avant leur mélange avec la matrice polymère. L'expression des protéines dans les cellules HeLa a été mesurée après transfection avec un polymère redissous pour cribler une combinaison de polymères qui produit une expression des protéines comparable aux LNP en suspension (n = 4 répétitions techniques). (dE) La taille des gouttelettes est essentielle pour une efficacité de chargement élevée du vaccin. En raison de l'effet Marangoni, une taille de gouttelette plus grande (d) a une efficacité de chargement inférieure à celle d'une petite gouttelette (e) distribuée au centre d'un moule. ( f ) Cellules HEK transfectées avec une suspension de LNP faite avec le lipide 5 et encapsulant l'ARNm codant pour le RBD. Les LNP encapsulant l'ARNm codant pour le RBD ont été dissous à partir d'un MNP et ajoutés pour démontrer la bioactivité après le chargement dans les MNP. RBD est représenté en vert (Alexa Fluor 488 utilisé comme anticorps secondaire), l'actine est représentée en rouge (rhodamine phalloïdine) et le noyau en bleu (DAPI). ( g ) Chargement de la pointe MNP (h) et efficacité de chargement de différentes constructions d'ARNm-LNP utilisées pour des études in vivo (n = 3 échantillons indépendants). Quatre MNP ont été administrés pour des études in vivo à 1,5 μg par patch pour donner une dose théorique de 6 μg. (i) Sur les 6 μg d'ARNm utilisés pour la fabrication de MNP, nous avons évalué le pourcentage d'ARNm récupéré dans diverses régions du MNP. Environ 25 % ont été trouvés dans les micro-aiguilles, correspondant à la mesure de l'efficacité de chargement, et l'ARNm restant a été trouvé dans le support. Le total rapporté est la somme des aiguilles et du support, montrant que tout l'ARNm a été pris en compte dans le MNP (n = 5 échantillons indépendants). Les données représentent la moyenne ± sd

( a ) Schéma d'immunisation pour une expérience in vivo chez des souris C57BL / 6. ( b ) Cinétique de l'expression de l'ARNm de FLuc telle que mesurée par luminescence. 1 μg d'ARNm dans les ARNm-LNP a été administré à des souris C57BL / 6 soit par injection intramusculaire (IM) soit par application de micro-aiguilles (MNP) (n = 5 échantillons biologiquement indépendants). L'expression de l'ARNm culmine plus tard pour les MNP par rapport à la suspension d'ARNm-LNP. ( c ) Expression de FLuc après 1 mois de stockage à 37 ° C dans des ARNm-LNP PVP: PVA 1: 1 MNP. Une ANOVA bidirectionnelle ordinaire (test de comparaisons multiples de Sidak) a été utilisée (n = 5 échantillons biologiquement indépendants). ( d ) Immunogénicité des patchs de micro-aiguilles stockés pendant 1 mois (1 mois) ou 3 mois (3 mois) à l'aide d'un test d'électrochimiluminescence qui mesure la force des réponses de liaison du domaine de liaison du récepteur de la protéine S SARS-CoV-2. Toutes les souris BALB/c ont été amorcées avec une dose de 10 μg d'ARNm SARS-CoV-2 RBD par injection intramusculaire (IM). A la semaine 4, une dose de rappel a été appliquée qui variait en fonction de la durée et des conditions de stockage, sauf pour un groupe qui n'a reçu aucun rappel à titre de comparaison. Le sérum a été prélevé à 3 semaines (pré-boost) et 9 semaines (post-boost) (n = 5 échantillons biologiquement indépendants). Les données représentent la moyenne ± sd NS, non significative.

Notes supplémentaires 1 à 4 et tableau supplémentaire 1.

Film S1.

Film S2.

Film S3.

Film S4.

Film S5.

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Réimpressions et autorisations

vander Straeten, A., Sarmadi, M., Daristote, JL et al. Une imprimante de vaccins à micro-aiguilles pour les vaccins thermostables à ARNm COVID-19. Nat Biotechnol (2023). https://doi.org/10.1038/s41587-023-01774-z

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Reçu : 10 janvier 2022

Accepté : 30 mars 2023

Publié: 24 avril 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41587-023-01774-z

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